מיקום אלקטרודות מעוררות חוץ-גולגולתיות ומדידת זרימת דם מוחית ושדות חשמליים תוך גולגולתיים בעכברים מורדמים
Summary
אנו מתארים פרוטוקול להערכת עקומות מנה-תגובה לגירוי חוץ-גולגולתי במונחים של מדידות שדה חשמלי במוח וזרימת דם רלוונטית של סמן ביולוגי-מוחי. מכיוון שפרוטוקול זה כולל החדרת אלקטרודות פולשניות למוח, יש צורך בהרדמה כללית, כאשר נשימה ספונטנית עדיפה על פני נשימה מבוקרת.
Abstract
זיהוי תגובות זרימת דם מוחיות (CBF) לצורות שונות של הפעלה עצבית הוא קריטי להבנת תפקוד המוח הדינמי ושינויים באספקת המצע למוח. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת תגובות CBF לגירוי זרם חילופין תוך גולגולתי (tACS). עקומות מנה-תגובה מוערכות הן משינוי CBF המתרחש עם tACS (mA) והן מהשדה החשמלי התוך גולגולתי (mV/mm). אנו מעריכים את השדה החשמלי התוך-גולגולתי בהתבסס על המשרעות השונות שנמדדו על-ידי מיקרואלקטרודות זכוכית בכל צד של המוח. במאמר זה, אנו מתארים את מערך הניסוי, הכולל שימוש בבדיקות דופלר לייזר דו-צדדיות (LD) או בדימות כתמי לייזר (LSI) כדי למדוד את CBF; כתוצאה מכך, מערך זה דורש הרדמה לצורך מיקום האלקטרודה ויציבותה. אנו מציגים מתאם בין תגובת CBF לבין הזרם כפונקציה של גיל, ומראים תגובה גדולה משמעותית בזרמים גבוהים יותר (1.5 mA ו- 2.0 mA) בחיות ביקורת צעירות (12-14 שבועות) בהשוואה לחיות מבוגרות יותר (28-32 שבועות) (p < 0.005 הפרש). אנו גם מדגימים תגובת CBF משמעותית בעוצמות שדה חשמלי <5 mV/mm, המהווה שיקול חשוב במחקרים בבני אדם בסופו של דבר. תגובות CBF אלה מושפעות מאוד גם משימוש בהרדמה בהשוואה לבעלי חיים ערים, מבקרת הנשימה (כלומר, נשימה אינטובטית לעומת נשימה ספונטנית), גורמים סיסטמיים (כלומר,CO2) והולכה מקומית בתוך כלי הדם, המתווכת על ידי פריציטים ותאי אנדותל. באופן דומה, טכניקות הדמיה/הקלטה מפורטות יותר עשויות להגביל את גודל השדה מהמוח כולו לאזור קטן בלבד. אנו מתארים את השימוש באלקטרודות חוץ-גולגולתיות ליישום גירוי tACS, כולל עיצובי אלקטרודות ביתיות ומסחריות עבור מכרסמים, המדידה המקבילה של CBF והשדה החשמלי התוך גולגולתי באמצעות אלקטרודות הקלטה DC מזכוכית דו-צדדית, וגישות ההדמיה. אנו מיישמים כיום טכניקות אלה כדי ליישם פורמט לולאה סגורה להגדלת CBF במודלים של בעלי חיים של מחלת אלצהיימר ושבץ.
Introduction
גירוי חשמלי תוך גולגולתי (tES; עם גירוי גל סינוס, tACS) היא גישה נפוצה, חיצונית ולא פולשנית לנוירומודולציהמוחית 1,2. בעבר, שיערנו כי במינונים מסוימים, tES (ובמיוחד tACS) עשוי להגביר את זרימת הדם במוח (CBF) באזורי המוח הבסיסיים3. יתר על כן, קשר מנה-תגובה עשוי להתקיים בין הזרם החיצוני המופעל או השדה החשמלי תוך גולגולתי לבין תגובות CBF הנובעות מכך. עם זאת, רוב פרוטוקולי הגירוי הקליניים התמקדו ברמת גירוי מקסימלית נוחה של העור (כלומר, ~ 2 mA) לפרקי זמן מתוכננים (כלומר, 30-45 דקות) כפרוטוקול טיפול 4,5. במכרסמים ניתן להשתמש באלקטרודות מוח חוץ-גולגולתיות פולשניות המופעלות ישירות על הגולגולת כדי לחקור את השדות החשמליים במוח המושרים על ידי tES6. לפיכך, מטרת גישה זו היא לקבוע את ההשפעות של עוצמת tACS בתדרים הרלוונטיים על שינויי CBF במונחים של יחסי מנה-תגובה. עקומת מינון-תגובה זו מבוססת על סמן ביולוגי פיזיולוגי קצר טווח – מדידות ישירות של CBF – ביחס לשדה החשמלי המוטל על המוח3. הראינו בעבר כי באמפליטודות גדולות יותר, בדרך כלל מעבר לטווח השדות החשמליים במוח המושרים על ידי tACS מבחינה קלינית, קיים מתאם כמעט ליניארי בין השדה החשמלי המושרה לבין CBF בקליפת המוח3. עם זאת, גירוי בשדה קטן יותר (כלומר, עוצמה של 1-5 mV/mm) עשוי להיות רלוונטי יותר ואפשרי יותר לשימוש בבני אדם; לפיכך, שינינו את הטכניקות שלנו כדי לזהות שינויים קטנים יותר ב- CBF.
מאמר זה מתאר פרוטוקול לניתוח ההשפעות של זרמי סינוס לסירוגין tES בחוזק שדה נמוך יותר (tACS) על CBF (כלומר, זרם 0.5-2.0 mA, שדה חשמלי 1-5 mV/mm), אשר יכול להיות נסבל על ידי מכרסמים ערים5. פרוטוקול זה כולל שימוש בדימות לייזר חדשני במהלך tACS, כמו גם אלקטרודות זכוכית תוך גולגולתית כפולות, כדי לקבוע הן את התפשטות tACS הפעיל בתוך המוח (כפי שמנוטר על-ידי CBF) והן את עוצמת השדה החשמלי התוך-גולגולתי, שמוצג גם כתרשים וגם כתצלום ניסויי ממשי (איור 1). ישנן השפעות פיזיולוגיות אפשריות רבות של tES במוח, כולל אפנון עצבי ישיר, פלסטיות עצבית והפעלת אסטרוציטים 7,8. למרות ש- CBF נמדד עם tDCS 9,10, מדידות אלה היו איטיות, עקיפות ולא מספיקות להערכת תפקוד המינון-תגובה במוח. לכן, על ידי שימוש בסמנים ביולוגיים מתאימים לטווח קצר (כלומר, CBF, שדות חשמליים) ורצפי הפעלה/כיבוי מהירים של tACS, אנו יכולים כעת להעריך את פונקציית תגובת המינון בצורה מדויקת יותר. יתר על כן, אנו יכולים ליישם טכניקות שונות למדידת CBF, כולל בדיקות דופלר לייזר מוקדיות (LD) והדמיית כתמי לייזר (LSI) עם אזורי עניין מוגדרים.
איור 1: דיאגרמת גירוי תוך גולגולתי ודוגמה צילומית . (A) דיאגרמה של מערך הגירוי הטרנס-גולגולתי. התרשים מציג גולגולת עכבר עם תפרים קורונליים וסגיטליים. האלקטרודות הטרנס-גולגולתיות ממוקמות לרוחב וסימטריה על הגולגולת ומותקנות בדבק כירורגי ובהדבקה מוליכה בין האלקטרודות לגולגולת. אלקטרודות אלה מחוברות למכשיר גירוי זרם קבוע התואם לבני אדם, שיכול לציין את התדירות, המשרעת ומשך הגירוי. לצורך הערכת שדות חשמליים תוך גולגולתיים, אלקטרודות זכוכית דו-צדדיות (~2 MΩ) ממוקמות בקליפת המוח (כלומר, בטווח של 1 מ”מ מהאספקט הפנימי של הגולגולת דרך חורי בור קטנים), ואלה אטומות בשמן מינרלי ויש להן קרקע AgCl בשריר הצוואר (מוצגים כחוטים גדולים יותר במרכז הקבורים ברקמת הצוואר התת עורית). אלקטרודות זכוכית אלה מחוברות למגבר DC, והיציאות שלהן נרשמות באמצעות דיגיטציה בעלת ארבעה ערוצים לפחות. בדיקות דופלר לייזר דו-צדדיות ממוקמות גם על הגולגולת לצורך הקלטות. הגולגולת כולה מצולמת גם באמצעות מכשיר הדמיה של כתמי לייזר או מצלמה מקוררת ברזולוציה גבוהה (לפחות 1,024 x 1,024 פיקסלים, עומק פיקסלים של 12-14 סיביות) לזיהוי אותות אופטיים פנימיים. התדר האיזוסבסטי של המוגלובין נבחר בדרך כלל (כלומר, 562 ננומטר) להארה לצורך הדמיית זרימת דם. (B) תמונת תקריב של ניסוי אמיתי, המראה את גשושיות דופלר הלייזר הדו-צדדיות (משמאל), את מיקרואלקטרודות רישום הזכוכית התוך-גולגולתית (הדו-צדדית) הממוקמות דרך חורי הבור, ועם אלקטרודות מעוררות tACS לרוחב. קיצור: tACS = גירוי זרם חילופין תוך גולגולתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
כדרך להעריך את המנגנונים, אנו יכולים גם לחקור אינטראקציות עם תהליכים פיזיולוגיים אחרים שגם משנים את CBF, כגון K+ המושרה התפשטות depolarization11. יתר על כן, במקום פגישות מתוכננות בזמנים קבועים, ניתן גם לפתח מערכת לולאה סגורה המבוססת על סמנים ביולוגיים נוספים למגוון מחלות, כפי שהוצע לטיפול באפילפסיה12 (כלומר, מכשירי נוירופייס קליניים). לדוגמה, גירוי מוחי בלולאה סגורה עבור מחלת פרקינסון מבוסס בדרך כלל על פוטנציאלי שדה מקומיים פנימיים חריגים (LFPs) המהותיים למחלה זו בהיעדר מספיק דופמין (בדרך כלל LFPs β-band)13.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתמקד במדידה in vivo, מורדמת, של תגובת CBF כסמן ביולוגי להערכת תגובת המוח ל-tES14. סמנים ביולוגיים ארוכי טווח של תגובת tES כוללים השפעות טיפול היסטולוגיות, כגון מניעה או שינויים בהיווצרות רובד העמילואיד (כלומר, עם גירוי גמא ב -40 הרץ במספר מודלים של אלצהיימר)16,17…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המענקים הבאים (ל- D.A.T.): NIA RO1 AG074999, NIA R21AG051103, VA I21RX002223 ו- VA I21 BX003023.
Materials
| Alcohol pads | HenryShein | 112-6131 | |
| Baby mineral oil | Johnson & Johnson | ||
| BD 1 mL syringe | Becton Dikinson | REF 305699 | |
| C3 Flat Surface Electrodes | Neuronexus | ||
| C57BI mice | from NIH colonies | ||
| Copper skull electrods | In house preparation | ||
| Digidata 1440, Clampex | Axon Instruments | ||
| Dumont #5 forceps | FST | #5 | |
| Dumont #7 forceps curved | Dumont | RS-5047 | |
| Eye ointment | Major | LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter instrument Co. | Model P-87 | |
| Forceps 11.5 cm slight curve serrated | Roboz | RS-8254 | |
| Intramedic needle 23 G | Becton Dikinson | REF 427565 | |
| KCl 1 M | In house preparation | ||
| Laser Doppler Probes | Moor Instruments | 0.46 mm laser doppler probes | |
| Laser Speckle Imaging Device | RWD | RFLSI-ZW | |
| Micro curette 13 cm | FST | 10080-05 | |
| Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm | Roboz | RS-5914 | |
| Mouse anesthesia fixation | Stoelting | ||
| Neuroconn-DS | Neurocare | DC-Stimulator Plus | |
| PhysioSuite Monitoring | Kent Scientific | ||
| Q-tips | Fisherbrand | 22363167 | |
| Saline 0.9% NaCl solution | Baxter | 281322 | |
| Sensicam QE | PCO Instruments | ||
| Software | Axon Instruments Clampex | ||
| Surgical glue | Covetrus | 31477 | |
| Surgical tape | 3M Transpore | T9784 |
References
- Bestmann, S., Walsh, V. Transcranial electrical stimulation. Current Biology. 27 (23), R1258-R1262 (2017).
- Bikson, M., et al. Rigor and reproducibility in research with transcranial electrical stimulation: An NIMH-sponsored workshop. Brain Stimulation. 11 (3), 465-480 (2018).
- Turner, D. A., Degan, S., Galeffi, F., Schmidt, S., Peterchev, A. V. Rapid, dose-dependent enhancement of cerebral blood flow by transcranial AC stimulation in mouse. Brain Stimulation. 14 (1), 80-87 (2020).
- Shah, S., Chhatbar, P. Y., Feld, J. A., Feng, W. Integrating tDCS into routine inpatient rehabilitation practice to boost post-stroke recovery. Brain Stimulation. 13 (4), 953-954 (2020).
- Voroslakos, M., et al. Direct effects of transcranial electric stimulation on brain circuits in rats and humans. Nature Communications. 9 (1), 483 (2018).
- Alekseichuk, I., Mantell, K., Shirinpour, S., Opitz, A. Comparative modeling of transcranial magnetic and electric stimulation in mouse, monkey, and human. Neuroimage. 194, 136-148 (2019).
- Tavakoli, A. V., Yun, K. Transcranial alternating current stimulation (tACS) mechanisms and protocols. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 214 (2017).
- Yavari, F., Jamil, A., Mosayebi Samani, M., Vidor, L. P., Nitsche, M. A. Basic and functional effects of transcranial electrical stimulation (tES)-An introduction. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 85, 81-92 (2018).
- Wachter, D., et al. Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat. Experimental Neurology. 227 (2), 322-327 (2011).
- Han, C. H., et al. Hemodynamic responses in rat brain during transcranial direct current stimulation: A functional near-infrared spectroscopy study. Biomedical Optics Express. 5 (6), 1812-1821 (2014).
- Ayata, C., Lauritzen, M. Spreading depression, spreading depolarizations, and the cerebral vasculature. Physiological Reviews. 95 (3), 953-993 (2015).
- Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation. Science. 337 (6095), 735-737 (2012).
- Hoang, K. B., Cassar, I. R., Grill, W. M., Turner, D. A. Biomarkers and stimulation algorithms for adaptive brain stimulation. Frontiers in Neuroscience. 11, 564 (2017).
- Turner, D., A, D. S., Hoffmann, U., Galleffi, F., Colton, C. A. CVN-AD Alzheimer’s mice show premature reduction in neurovascular coupling in response to spreading depression and anoxia compared to aged controls. Alzheimer’s and Dementia. 17 (7), 1109-1120 (2021).
- Colton, C. A., et al. mNos2 deletion and human NOS2 replacement in Alzheimer disease models. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 73 (8), 752-769 (2014).
- Castano-Prat, P., et al. Altered slow (<1 Hz) and fast (beta and gamma) neocortical oscillations in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer’s disease under anesthesia. Neurobiology of Aging. 79, 142-151 (2019).
- Etter, G., et al. Optogenetic gamma stimulation rescues memory impairments in an Alzheimer’s disease mouse model. Nature Communications. 10 (1), 5322 (2019).
- Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
- Martorell, A. J., et al. Multi-sensory gamma stimulation ameliorates Alzheimer’s-associated pathology and improves cognition. Cell. 177 (2), 256-271 (2019).
- Dawson, J., et al. Vagus nerve stimulation paired with rehabilitation for upper limb motor function after ischaemic stroke (VNS-REHAB): A randomised, blinded, pivotal, device trial. Lancet. 397 (10284), 1545-1553 (2021).
- Hacker, M. L., et al. Deep brain stimulation in early-stage Parkinson disease: Five-year outcomes. Neurology. 95 (4), e393-e401 (2020).
- Duun-Henriksen, J., et al. A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings. Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).
- Haneef, Z., et al. Sub-scalp electroencephalography: A next-generation technique to study human neurophysiology. Clinical Neurophysiology. 141, 77-87 (2022).
