Isolering och odling av primära synoviala makrofager och fibroblaster från murin artritvävnad
Summary
Den aktuella studien ger ett modifierat protokoll för att isolera synoviala makrofager och fibroblaster från murin inflammatorisk artritvävnad.
Abstract
Reumatoid artrit är en autoimmun sjukdom som leder till kronisk inflammation i lederna. Synoviala makrofager och synoviala fibroblaster har centrala roller i patogenesen av reumatoid artrit. Det är viktigt att förstå funktionerna hos båda cellpopulationerna för att avslöja mekanismerna bakom patologisk progression och remission vid inflammatorisk artrit. I allmänhet bör in vitro-experimentella förhållanden efterlikna in vivo-miljön så mycket som möjligt. Primära vävnadshärledda celler har använts i experiment som karakteriserar synoviala fibroblaster vid artrit. Däremot har i experiment som undersöker de biologiska funktionerna hos makrofager vid inflammatorisk artrit använts cellinjer, benmärgshärledda makrofager och blodmonocyt-härledda makrofager. Det är emellertid oklart om sådana makrofager faktiskt återspeglar funktionerna hos vävnadsbosatta makrofager. För att erhålla inhemska makrofager modifierades tidigare protokoll för att isolera och expandera både primära makrofager och fibroblaster från synovialvävnad i en inflammatorisk artritmusmodell. Dessa primära synovialceller kan vara användbara för in vitro-analys av inflammatorisk artrit.
Introduction
Reumatoid artrit (RA) är en autoimmun sjukdom som kännetecknas av hyperplasi av synovium, vilket leder till leddestruktion 1,2. Vävnadsbosatta makrofager och fibroblaster finns i friska synovium för att upprätthålla gemensam homeostas. Hos RA-patienter prolifererar synoviala fibroblaster (SF) och immunceller, inklusive monocyter, infiltrerar i synovium och ledvätska, processer associerade med inflammation 1,3,4. Synoviala makrofager (SM), som inkluderar bosatta makrofager och perifera blodmonocyt-härledda makrofager, och SF aktiveras avvikande och har viktiga roller i RA-patogenes. Nya studier har föreslagit att cell-cellinteraktioner mellan SM och SF bidrar till både exacerbation och remission av RA 5,6.
För att förstå RA-patogenes har flera gnagarmodeller av inflammatorisk artrit använts, inklusive K / BxN-serumöverföringsartrit, kollageninducerad artrit och kollagenantikroppsinducerad artrit. Cellbaserade analyser krävs i allmänhet för att klargöra molekylära funktioner vid artrit. Därför har primära celler från djurmodeller av artrit isolerats. Metoden att isolera SF från murin artritvävnad är väl etablerad, och dessa celler har bidragit till klarläggandet av molekylära mekanismer vid artritpatogenes 7,8. Å andra sidan har benmärgshärledda makrofager, blodmonocyt-härledda makrofager och makrofagcellinjer ofta använts som makrofagresurser för artritstudier 9,10. Eftersom makrofager kan förvärva funktioner associerade med deras mikromiljö kan allmänna källor till makrofager sakna svar som är specifika för artritvävnad. Dessutom är det svårt att få tillräckligt med synovialceller genom sortering, eftersom murin synovium är en mycket liten vävnad även i artritmodeller. Bristen på användning av synoviala makrofager för in vitro-studier har varit en begränsning i artritstudier. Upprättandet av ett protokoll för att isolera och expandera synoviala makrofager skulle vara en fördel för att belysa patologiska mekanismer vid RA.
I den tidigare metoden för att isolera SF kasserades SM7. Dessutom rapporterades en metod för att isolera och expandera bosatta makrofager från vissa organ11. Därför ändrades befintliga protokoll i kombination. Modifieringen syftar till att uppnå den primära kulturen för både SM och SF med hög renhet. Det övergripande målet med denna metod är att isolera och expandera både SM och SF från murin artritvävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod som utvecklats här förbättrar tidigare tekniker för att isolera både SF från murin artrit och bosatta makrofager från ett antal organ 7,11. Den modifierade metoden kan isolera både makrofager och fibroblaster från inflammatoriskt synovium med hög renhet, och det är enkelt och reproducerbart. Eftersom metoden inte kräver komplexa instrument som en cellsorterare kan vem som helst genomföra den. Dessutom undviker den nuvarande tekniken probl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar personalen vid avdelningen för medicinskt forskningsstöd, Advanced Research Support Center (ADRES) och medlemmarna i avdelningen för integrativ patofysiologi, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, för deras tekniska hjälp och hjälpsamma stöd. Denna studie stöddes delvis av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-bidrag JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (till NS) och JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (till YI); bidrag från Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (till NS); och ett Takeda Science Foundation Medical Research-bidrag, UCB Japan (UCBJ) projektbidrag och JSBMR Frontier Scientist-bidraget 2019 (till YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
References
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
