Isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel
Summary
De huidige studie biedt een aangepast protocol om synoviale macrofagen en fibroblasten te isoleren uit murine inflammatoire artritisweefsel.
Abstract
Reumatoïde artritis is een auto-immuunziekte die leidt tot chronische ontsteking van gewrichten. Synoviale macrofagen en synoviale fibroblasten spelen een centrale rol in de pathogenese van reumatoïde artritis. Het is belangrijk om de functies van beide celpopulaties te begrijpen om de mechanismen te onthullen die ten grondslag liggen aan pathologische progressie en remissie bij inflammatoire artritis. Over het algemeen moeten in vitro experimentele omstandigheden de in vivo omgeving zoveel mogelijk nabootsen. Primaire weefsel-afgeleide cellen zijn gebruikt in experimenten die synoviale fibroblasten bij artritis karakteriseren. Daarentegen zijn in experimenten die de biologische functies van macrofagen bij inflammatoire artritis onderzoeken, cellijnen, van beenmerg afgeleide macrofagen en van bloedmonocyten afgeleide macrofagen gebruikt. Het is echter onduidelijk of dergelijke macrofagen daadwerkelijk de functies van weefselresidente macrofagen weerspiegelen. Om residente macrofagen te verkrijgen, werden eerdere protocollen aangepast om zowel primaire macrofagen als fibroblasten uit synoviaal weefsel te isoleren en uit te breiden in een inflammatoir artritismuismodel. Deze primaire synoviale cellen kunnen nuttig zijn voor in vitro analyse van inflammatoire artritis.
Introduction
Reumatoïde artritis (RA) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door hyperplasie van het synovium, wat leidt tot gewrichtsvernietiging 1,2. Weefsel-residente macrofagen en fibroblasten zijn aanwezig in gezond synovium om de gezamenlijke homeostase te behouden. Bij RA-patiënten prolifereren synoviale fibroblasten (SF’s) en infiltreren immuuncellen, waaronder monocyten, in het synovium en gewrichtsvloeistof, processen geassocieerd met ontsteking 1,3,4. Synoviale macrofagen (SM’s), waaronder residente macrofagen en van perifere bloedmonocyten afgeleide macrofagen, en SF’s worden afwijkend geactiveerd en hebben een belangrijke rol in de pathogenese van RA. Recente studies hebben gesuggereerd dat cel-cel interacties tussen SM’s en SF’s bijdragen aan zowel de exacerbatie als de remissie van RA 5,6.
Om RA-pathogenese te begrijpen, zijn verschillende knaagdiermodellen van inflammatoire artritis gebruikt, waaronder K / BxN-serumtransferartritis, collageen-geïnduceerde artritis en collageenantilichaam-geïnduceerde artritis. Celgebaseerde assays zijn over het algemeen nodig om moleculaire functies bij artritis te verduidelijken. Daarom zijn primaire cellen uit diermodellen van artritis geïsoleerd. De methode om SF’s te isoleren uit muizenartritisweefsel is goed ingeburgerd en deze cellen hebben bijgedragen aan de opheldering van moleculaire mechanismen in artritispathogenese 7,8. Aan de andere kant zijn van beenmerg afgeleide macrofagen, van bloedmonocyten afgeleide macrofagen en macrofaagcellijnen vaak gebruikt als macrofaagbronnen voor artritisstudies 9,10. Omdat macrofagen functies kunnen verwerven die verband houden met hun micro-omgeving, kunnen algemene bronnen van macrofagen reacties missen die specifiek zijn voor artritisweefsel. Bovendien is het moeilijk om voldoende synoviale cellen te verkrijgen door te sorteren, omdat muizensynovium een zeer klein weefsel is, zelfs in artritismodellen. Het gebrek aan gebruik van synoviale macrofagen voor in vitro studies is een beperking geweest in artritisstudies. De vaststelling van een protocol om synoviale macrofagen te isoleren en uit te breiden zou een voordeel zijn voor de opheldering van pathologische mechanismen bij RA.
Bij de vorige methode om SF’s te isoleren, werden SM’s weggegooid7. Daarnaast werd een methode gemeld om residente macrofagen uit sommige organen te isoleren en uit te breiden11. Daarom werden bestaande protocollen in combinatie aangepast. De modificatie is gericht op het bereiken van de primaire cultuur van zowel SM’s als SF’s met een hoge zuiverheid. Het algemene doel van deze methode is om zowel SM’s als SF’s uit muizenartritisweefsel te isoleren en uit te breiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze hier ontwikkelde methode verbetert eerdere technieken voor het isoleren van zowel SF’s van muizenartritis als residente macrofagen van een aantal organen 7,11. De gemodificeerde methode kan zowel macrofagen als fibroblasten isoleren van inflammatoir synovium met een hoge zuiverheid, en het is eenvoudig en reproduceerbaar. Omdat de methode geen complexe instrumenten zoals een celsorteerder vereist, kan iedereen het uitvoeren. Bovendien vermijdt de huidige tec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het personeel van de afdeling Medical Research Support, het Advanced Research Support Center (ADRES) en de leden van de afdeling Integratieve Pathofysiologie, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, voor hun technische assistentie en nuttige ondersteuning. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-subsidies JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (aan NS) en JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (aan YI); subsidies van de Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (aan NS); en een Takeda Science Foundation Medical Research-beurs, UCB Japan (UCBJ) projectsubsidie en de JSBMR Frontier Scientist-beurs 2019 (aan YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
References
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
