Karakterisering av pattedyrsinktransportører ved bruk av en in vitro sinktransportanalyse
Summary
Sinktransport har vist seg utfordrende å måle på grunn av de svake årsakssammenhengene til proteinfunksjon og den lave temporale oppløsningen. Denne protokollen beskriver en metode for overvåking, med høy temporal oppløsning, Zn 2+ ekstrudering fra levende celler ved å benytte et Zn 2+ sensitivt fluorescerende fargestoff, og gir dermed et direkte mål på Zn2+ utstrømning.
Abstract
Overgangsmetaller som Zn2+-ioner må reguleres tett på grunn av deres cellulære toksisitet. Tidligere ble aktiviteten til Zn 2+-transportører målt indirekte ved å bestemme ekspresjonsnivået til transportøren under forskjellige konsentrasjoner av Zn2+. Dette ble gjort ved å bruke immunhistokjemi, måle mRNA i vevet, eller bestemme de cellulære Zn2+ nivåene. Med utviklingen av intracellulære Zn 2+-sensorer bestemmes sinktransportørers aktiviteter for tiden primært ved å korrelere endringer i intracellulær Zn 2+, detektert ved hjelp av fluorescerende prober, med uttrykket av Zn2+-transportørene. Men selv i dag er det bare noen få laboratorier som overvåker dynamiske endringer i intracellulær Zn2+ og bruker den til å måle aktiviteten til sinktransportører direkte. En del av problemet er at av de 10 sinktransportørene i ZnT-familien, bortsett fra ZnT10 (transporterer mangan), er bare sinktransportør 1 (ZnT1) lokalisert ved plasmamembranen. Derfor er det vanskelig å knytte transportaktiviteten til endringer i den intracellulære Zn2+-konsentrasjonen. Denne artikkelen beskriver en direkte måte å bestemme sinktransportkinetikken ved hjelp av en analyse basert på et sinkspesifikt fluorescerende fargestoff, FluoZin-3. Dette fargestoffet lastes inn i pattedyrceller i sin esterform og fanges deretter i cytosolen på grunn av cellulær di-esteraseaktivitet. Cellene er lastet med Zn 2+ ved å bruke Zn2+ ionoforpyrition. ZnT1-aktiviteten vurderes ut fra den lineære delen av reduksjonen i fluorescens etter celleutvaskingen. Fluorescensen målt ved en eksitasjon på 470 nm og utslipp på 520 nm er proporsjonal med den frie intracellulære Zn2+. Ved å velge cellene som uttrykker ZnT1 merket med mCherry-fluoroforen, kan du bare overvåke cellene som uttrykker transportøren. Denne analysen brukes til å undersøke bidraget fra forskjellige domener av ZnT1-protein til transportmekanismen til humant ZnT1, et eukaryot transmembranprotein som ekstruderer overflødig sink fra cellen.
Introduction
Sink er et viktig sporelement i det cellulære miljøet. Den inneholder en tredjedel av alle proteiner og er involvert i forskjellige cellulære prosesser, som katalyse1, transkripsjon2 og strukturelle motiver3. Til tross for at de er redoks-inerte, er høye sinkkonsentrasjoner giftige for cellen, og derfor har ingen pattedyrsorganisme overlevd uten tilstedeværelse av mekanismer som regulerer sinkhomeostase. Hos pattedyr er tre mekanismer ansvarlige for denne prosessen: (1) metallothioneiner, som er cytosoliske cysteinrike proteiner som binder sink med høy affinitet, og dermed forhindrer overflødig fri cytosolisk sink4; (2) Zrt / Irt-lignende proteiner (ZIP), som er sinktransportører som er ansvarlige for sinkinnstrømning i cytosolen gjennom plasmamembranen eller fra intracellulære organeller 4,5,6,7,8; og (3) ZnTs, som er en pattedyrundergruppe av den allestedsnærværende kationdiffusjonsfasilitatorfamilien (CDF) og er sinktransportører, da de ekstruderer sink fra cytosolen over plasmamembranen eller inn i de intracellulære organellene 4,5,6,7,8,9. På grunn av sinkens betydning for cellulær metabolisme, er det viktig å forstå cellulær sinkdynamikk.
Tidligere metoder for å vurdere sinkdynamikk var avhengig av å vurdere ekspresjonsnivåene av mRNA under forskjellige sinkforhold ved å korrelere dem med cellulære sinkmålinger av faste vev eller celler10,11,12. Disse metodene inkluderer kjemisk deteksjon og immunhistokjemifarging. Imidlertid gir disse metodene bare indirekte tiltak og bestemmer dermed bare en offline korrelasjon mellom intracellulær sinkkonsentrasjon og ekspresjonen av sinktransportører. Følgelig kan disse metodene ikke utlede noen parametere som krever høy temporal oppløsning.
En mer direkte måling av Zn2+ -transport bruker radioaktive isotoper av sink13. Denne metoden er avhengig av måling av radiomerket Zn2+ for å overvåke sinktransport og kinetikk. På grunn av sinkens betydning for cellulær homeostase regulerer imidlertid flere cellulære prosesser intracellulær sinkkonsentrasjon. Blant disse er ekstracellulær binding og flere transportsystemer som fungerer sammen for å opprettholde tett kontroll over intracellulære Zn2+ nivåer. Kombinasjonen av disse prosessene skaper betydelig bakgrunnsstøy, noe som gjør det vanskelig å teste individuelle sinkrelaterte transportfunksjoner.
Denne artikkelen demonstrerer en metode for direkte overvåking av sinktransporthastigheten ved å måle den intracellulære konsentrasjonen av fritt sink ved bruk av et sinkspesifikt fluorescerende fargestoff, FluoZin-3. Fargestoffet har høy spesifisitet for Zn2+ og liten interferens fra andre divalente kationer, som kalsium. I tillegg, i sin esterform, kommer den inn i cellene ved ikke-ionisk diffusjon og blir deretter fanget på grunn av aktiviteten til intracellulær di-esterase. Dermed er dens fluorescens korrelert primært med den frie cytosoliske sinkkonsentrasjonen. Disse eksperimentene ble utført for å studere struktur-funksjonsforholdet mellom sinktransportør 1 (ZnT1), et medlem av ZnT-familien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ovenfor beskrevne metoden tillater direkte måling av den intracellulære sinkkonsentrasjonen med høy temporal oppløsning. Sammenlignet med andre metoder, kan denne metoden som involverer overvåking av endringer i intracellulær Zn2+ redusere bakgrunnsstøy betydelig. I tillegg eliminerer fargestoffets selektivitet for sink potensielle kryssinteraksjoner med andre metallkationer18,19. Endelig muliggjør mangelen på umiddelbar cytotoksisitet tes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach er støttet av Israel Science Foundation (grant no. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef og Arie Moran er støttet av Israel Science Foundation (stipend nr. 2047/20). Vi vil gjerne takke Daniel Gitler og hans gruppe ved Ben-Gurion University for deres samarbeid, støtte og ekspertise.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters – A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer’s disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer’s disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d., Findley, S. d. Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
