Vi beskriver ett protokoll för att isolera murina tunntarmskryptor och odla intestinala 3D-organoider från krypterna. Dessutom beskriver vi en metod för att generera organoider från en enda tarmstamcell i frånvaro av en subepitelial cellulär nisch.
Idag utgör organoidodling ett viktigt verktyg för in vitro-studier av olika biologiska aspekter och sjukdomar i olika organ. Murina tunntarmskrypter kan bilda organoider som efterliknar tarmepitelet när de odlas i en 3D extracellulär matris. Organoiderna består av alla celltyper som uppfyller olika intestinala homeostatiska funktioner. Dessa inkluderar Paneth-celler, enteroendokrina celler, enterocyter, bägarceller och tuftceller. Välkarakteriserade molekyler tillsätts i odlingsmediet för att berika tarmstamcellerna (ISC) märkta med leucinrika upprepningar innehållande G-proteinkopplad receptor 5 och används för att driva differentiering ner specifika linjer; dessa molekyler innefattar epidermal tillväxtfaktor, Noggin (ett benmorfogenetiskt protein) och R-spondin 1. Dessutom beskrivs också ett protokoll för att generera organoider från en enda erytropoietinproducerande hepatocellulär receptor B2 (EphB2)-positiv ISC. I denna metodartikel beskrivs tekniker för att isolera tunntarmskrypter och en enda ISC från vävnader och säkerställa effektiv etablering av organoider.
Intestinala organoider, som först etablerades 2009, har framstått som ett kraftfullt in vitro-verktyg för att studera tarmbiologi med tanke på deras morfologiska och funktionella likhet med mogna vävnader. Nyligen har tekniska framsteg inom odlade organoider härrörande från stamceller från vuxenvävnad möjliggjort långsiktig odling av tarmstamceller (ISC) med självförnyelse och differentieringspotential. Dessa organoider har använts i stor utsträckning för grundläggande och translationella forskningsstudier om gastrointestinal fysiologi och patofysiologi 1,2,3,4,5,6. 3D-organoiderna som utvecklats av Clevers-gruppen ger ett kraftfullt verktyg för att studera tarmepitelet med förbättrad fysiologisk relevans7. Eftersom intestinala organoider härrör från vävnadsstamceller och består av flera celltyper, rekapitulerar de funktionaliteten hos tarmepitelet. Observera att en enkelsorterad leucinrik upprepningsinnehållande G-proteinkopplad receptor 5-positiv (Lgr5+) stamcell också kan generera 3D-organoider utan några Paneth-celler eller en ISC-nisch som epitelnisch eller stromal nisch7. Den organoidbildande kapaciteten hos enkelsorterade Lgr5+-celler är dock låg jämfört med krypt- och ISC-Paneth-celldubbletter8.
Ett ökande antal studier har visat att metoderna för etylendiamintetraättiksyra (EDTA) inkubation eller kollagenasdissociation orsakar lossning i epitelet och frisättning av krypter. Eftersom enzymatisk dissociation kan ha en effekt på celltillståndet hos krypter, används vanligtvis en mekanisk isoleringsmetod för att dissociera vävnaden. Även om mekanisk matsmältning är en snabb teknik, kan denna metod associeras med inkonsekventa kryptutbyten eller dålig cellviabilitet9. Därför kan EDTA-behandling och mekanisk dissociation kombineras för att generera bättre kryptutbyten. En egenskap hos metoden som visas i denna artikel är användningen av kraftig skakning av vävnadsfragmenten efter EDTA-kelering10. Kraftig skakning möjliggör effektiv isolering av krypter från krypt-villuskomplex i tunntarmen. Graden av manuell skakning bestämmer separationen. Således är det viktigt att erhålla krypter från komplex för experimenter inom detta område. Dessutom kan rätt skicklighet minska villusförorening till ett minimum och öka antalet krypter.
Därför kan detta experimentella protokoll, som använder murin-härledda tunntarmsorganoider, bättre isolera krypter med fysisk kraft efter behandling med EDTA för dissociation. Det är känt att uttrycksmönstret för erytropoietinproducerande hepatocellulär receptor B2 (EphB2) delvis återspeglar kryptmiljön. Till exempel är EphB2-positiva celler organiserade från botten till topp11. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) utfördes baserat på EphB2-uttrycket, och de erhållna cellerna delades in i fyra grupper: EphB2hög, EphB2med, EphB2låg och EphB2neg. Därefter demonstrerades organoidtillväxten från enstaka sorterade EphB2-höga celler i vildtypsmöss (WT).
Detta protokoll beskriver en metod för att konsekvent isolera tunntarmskrypter och den efterföljande kulturen av 3D-organoider. För att förbättra krypteringsfrisättningshastigheten etablerades en mekanisk isoleringsmetod med kraftig skakning efter behandling med EDTA. Mediesammansättningen skiljer sig från det ursprungliga protokollet från Sato et al.7. Det ursprungliga mediet är relativt kostsamt. Således visas ett odlingsmedium och anpassade medier för murina tunntarmsorganoider innehållande farmakologiska hämmare, rekombinanta tillväxtfaktorer och/eller konditionerade medier i tabell 1. Wnt3A och N-acetylcystein ingår inte i odlingsmediet i detta protokoll. När Paneth-celler uttrycker Wnt3 producerar cellerna Wnt3 och stöder ISC-underhåll. Dessutom, under kryptisolering, används inte det konditionerade mediet. Organoidmodellen är dynamisk och har cellulär och strukturell heterogenitet (Paneth-celler, enterocyter, bägarceller, enteroendokrina celler, tuftceller och ISC). Därför kan dessa organoider användas i stor skala för att studera grundläggande frågor om organoidbiologi.
EphB2-gradienten upprätthåller ISC-stamhet och spridning längs krypt-villusaxeln i den vuxna tunntarmen18. Fördelen med att göra organoider från en enda EphB2-cell jämfört med isolerade krypter avser att förstå biologin hos murina ISC: er, eftersom ISC spelar nyckelroller i olika mänskliga tarmsjukdomar. Enstaka EphB2höguttryckande ISC kan odlas för att bilda organoider på ett liknande sätt som utvecklingen av organoider från enstaka Lgr5-uttryckande ISC. Det viktigaste steget är att exakt dela upp cellerna i fyra grupper (EphB2hög, EphB2 med, EphB2låg och EphB2neg) enligt EphB2-uttrycket i krypternamed FACS. Framåt kontra sidospridningsdiagram (FSC kontra SSC) används ofta för att identifiera intressanta celler baserat på deras storlek och granularitet. FSC anger cellstorleken och SSC relaterar till cellens komplexitet eller granularitet i P0-grinden (figur 2A). I detta arbete analyserades därefter cellerna som föll inom den definierade grinden (P0) för livskraft. Därefter bestämdes deras livskraft enligt de negativa och positiva populationerna av 7-AAD-fluorescenssignaler. Gränsen mellan de 7-AAD-negativa och -positiva cellerna bestämdes strikt för att få de negativa med minimal positiv cellkontaminering. EphB2-grindarna sattes grovt baserat på EphB2-graderat uttryck.
För att bekräfta att de fyra grupperna var exakt uppdelade analyserades mRNA-uttrycket av utvalda gener. MRNA-nivåerna av ISC-markörer är höga i EphB2höga celler20. Dessutom är mRNA-nivåerna av stamcellsspecifika markörer relativt höga i EphB2med celler20. EphB2-exdpressionen i EphB2låga och EphB2neg-celler är dock låg eller negativ jämfört med EphB2hög och EphB2med celler20. Föregående åtgärder bör vidtas för att säkerställa anrikning avEphB2-högcellspopulationen före plätering. Organoidtillväxt på mindre än 6% från EphB2höga celler kan dock bero på stamcellernas död under odlingsprocessen, inte den kraftiga skakningen under kryptisoleringen. Det har visats att tillämpningen av en selektiv Rho-associerad kinas (ROCK)-hämmare på mänskliga embryonala stamceller markant minskar dissociationsinducerad apoptos22. Således, som en teknisk förändring, är det värt att försöka tillsätta ROCK-hämmaren i en högre koncentration och med en längre inkubation för att förbättra livskraften.
Wnt3A-utsöndrande Paneth-celler bredvid ISC ger viktigt stöd till ISC8. Faktum är att ISC-Paneth-celldubbletter uppvisar en starkt ökad organoidbildande kapacitet jämfört med enskilda ISC8. Dessutom har tillsatsen av Wnt3A vid koncentrationen 100 ng/ml under de första 3 odlingsdagarna visat sig öka den organoidbildande kapaciteten8. Således, som en annan teknisk förändring, kan tillägg av exogent Wnt3A förbättra organoidbildande kapacitet hos enstaka EphB2höguttryckande ISC.
Jämfört med in vivo-metoder kan organoider enkelt användas för genetisk manipulation, analys av malignitetsfenotyper och läkemedelsscreening20,23. En kombination av EDTA-kelering och en mekanisk isoleringsmetod är effektiv, reproducerbar och tidseffektiv för att skapa tunntarmsorganoider från krypter och kan enkelt följas av laboratoriepersonal utan avancerad erfarenhet. Således kan tillsatsen av den mekaniska isoleringen med kraftig skakning efter behandlingen med EDTA effektivt etablera murina tunntarmsorganoider ex vivo och ge ett potentiellt verktyg för organoidodling och sjukdomsmodellering av andra vuxna epitelvävnader.
Intestinala epitelceller är polariserade och orienterade med den apikala sidan riktad mot lumen. Den apikala sidan som vetter mot lumen av 3D-organoider är dock i deras inre. Således förhindrar denna organisation åtkomst till den apikala sidan, vilket är ett problem när man studerar effekterna av luminala komponenter, såsom näringsämnen, mikrober och metaboliter på epitelceller. För att kringgå denna nackdel har en odling av organoidceller som 2D-monolager utvecklats24. När det gäller framtida tillämpningar kommer kulturen av organoidcellmonolager att utnyttjas, eftersom detta representerar det mest effektiva och lätthanterliga systemet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Grants-in-Aid for Scientific Research (C) till T.T. (bidragsnummer JP17K07495 och JP20K06751). Vi tackar professor Mineko Kengaku för användningen av utrustning för långsiktig time-lapse-avbildning (LCV100; Olympen).
1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |