हम मुराइन छोटे आंतों के क्रिप्ट्स को अलग करने और क्रिप्ट्स से आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम एक उप-उपकला सेलुलर आला की अनुपस्थिति में एकल आंतों के स्टेम सेल से ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करते हैं।
वर्तमान में, ऑर्गेनॉइड संस्कृति विभिन्न अंगों में विभिन्न जैविक पहलुओं और बीमारियों के इन विट्रो अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है। मुराइन छोटे आंतों के क्रिप्ट ऑर्गेनोइड बना सकते हैं जो 3 डी बाह्य मैट्रिक्स में सुसंस्कृत होने पर आंतों के उपकला की नकल करते हैं। ऑर्गेनोइड्स सभी सेल प्रकारों से बने होते हैं जो विभिन्न आंतों के होमियोस्टैटिक कार्यों को पूरा करते हैं। इनमें पनेथ कोशिकाएं, एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं, एंटरोसाइट्स, गोब्लेट कोशिकाएं और टफ्ट कोशिकाएं शामिल हैं। अच्छी तरह से विशेषता वाले अणुओं को आंतों के स्टेम कोशिकाओं (आईएससी) को समृद्ध करने के लिए संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है, जो जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 5 युक्त ल्यूसीन युक्त दोहराव के साथ लेबल किया जाता है और विशिष्ट वंशों में भेदभाव को चलाने के लिए उपयोग किया जाता है; इन अणुओं में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर, नोगिन (एक हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन), और आर-स्पोंडिन 1 शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, एकल एरिथ्रोपोइटिन-उत्पादक हेपेटोसेलुलर रिसेप्टर बी 2 (एएफबी 2) -पॉजिटिव आईएससी से ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी विस्तृत है। इस विधि लेख में, ऊतकों से छोटे आंतों के क्रिप्ट और एक एकल आईएससी को अलग करने और ऑर्गेनोइड्स की कुशल स्थापना सुनिश्चित करने की तकनीकों का वर्णन किया गया है।
आंतों के ऑर्गेनोइड्स, जो पहली बार 2009 में स्थापित किए गए थे, परिपक्व ऊतकों के लिए उनकी रूपात्मक और कार्यात्मक समानता को देखते हुए आंतों के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली इन विट्रो उपकरण के रूप में उभरे हैं। हाल ही में, वयस्क-ऊतक स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स में तकनीकी प्रगति ने आत्म-नवीकरण और भेदभाव क्षमता के साथ आंतों के स्टेम कोशिकाओं (आईएससी) की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुमति दी है। इन ऑर्गेनोइड्स का व्यापक रूप से गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फिजियोलॉजी और पैथोफिज़ियोलॉजी 1,2,3,4,5,6 पर बुनियादी और ट्रांसलेशनल शोध अध्ययनों के लिए उपयोग किया गया है। क्लेवर्स समूह द्वारा विकसित 3 डी ऑर्गेनोइड्स बेहतर शारीरिक प्रासंगिकता के साथ आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदानकरते हैं। चूंकि आंतों के ऑर्गेनोइड ऊतक स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं और कई सेल प्रकारों से बने होते हैं, इसलिए वे आंतों के उपकला की कार्यक्षमता को पुन: उत्पन्न करते हैं। ध्यान दें, एक एकल-क्रमबद्ध ल्यूसीन-समृद्ध दोहराव युक्त जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 5-पॉजिटिव (एलजीआर 5+) स्टेम सेल भी किसी भी पेनेथ कोशिकाओं या आईएससी आला जैसे उपकला आला या स्ट्रोमल आला 7 के बिना 3 डी ऑर्गेनोइड उत्पन्न कर सकताहै। हालांकि, क्रिप्ट और आईएससी-पेनेथ सेल डबल्स8 की तुलना में एकल-क्रमबद्ध एलजीआर 5 + कोशिकाओं की ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता कम है।
अध्ययनों की बढ़ती संख्या से पता चला है कि एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) इनक्यूबेशन या कोलेजनेज पृथक्करण के तरीके एपिथेलियम में ढीलापन और क्रिप्ट्स की रिहाई का कारण बनते हैं। चूंकि एंजाइमैटिक पृथक्करण का क्रिप्ट्स की कोशिका स्थिति पर प्रभाव पड़ सकता है, इसलिए आमतौर पर ऊतक को अलग करने के लिए एक यांत्रिक अलगाव विधि का उपयोग किया जाता है। हालांकि यांत्रिक पाचन एक तेज़ तकनीक है, इस विधि को असंगत क्रिप्ट पैदावार या खराब सेल व्यवहार्यता 9 के साथ जोड़ा जा सकताहै। इसलिए, ईडीटीए उपचार और यांत्रिक पृथक्करण को बेहतर क्रिप्ट पैदावार उत्पन्न करने के लिए जोड़ा जा सकता है। इस लेख में दिखाई गई पद्धति की एक विशेषता ईडीटीए चेलेशन10 के बाद ऊतक के टुकड़ों के जोरदार झटकों का उपयोग है। जोरदार झटके छोटी आंत में क्रिप्ट-विलस कॉम्प्लेक्स से क्रिप्ट्स के कुशल अलगाव की अनुमति देते हैं। मैन्युअल झटकों की डिग्री पृथक्करण को निर्धारित करती है। इस प्रकार, इस क्षेत्र में प्रयोगकर्ताओं के लिए परिसरों से क्रिप्ट प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, उचित कौशल विलस संदूषण को कम से कम कर सकता है और क्रिप्ट की संख्या बढ़ा सकता है।
इसलिए, यह प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, जो मुराइन-व्युत्पन्न छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स को नियोजित करता है, पृथक्करण के लिए ईडीटीए के साथ उपचार के बाद भौतिक बल के साथ क्रिप्ट को बेहतर ढंग से अलग कर सकता है। यह ज्ञात है कि एरिथ्रोपोइटिन-उत्पादक हेपेटोसेलुलर रिसेप्टर बी 2 (एएफबी 2) का अभिव्यक्ति पैटर्न क्रिप्ट वातावरण को दर्शाता है। उदाहरण के लिए, EphB2-पॉजिटिव कोशिकाओं को नीचे से शीर्ष11 तक व्यवस्थित किया जाता है। प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) को एएफबी 2 अभिव्यक्ति के आधार पर किया गया था, और प्राप्त कोशिकाओं को चार समूहों में विभाजित किया गया था: एएफबी 2उच्च, एएफबी 2मेड, एएफबी 2कम, और एएफबी 2नेग। फिर, जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों में एकल-क्रमबद्ध एएफबी 2उच्च कोशिकाओं से ऑर्गेनोइड वृद्धि का प्रदर्शन किया गया था।
यह प्रोटोकॉल लगातार छोटे आंतों के क्रिप्ट और 3 डी ऑर्गेनोइड्स की बाद की संस्कृति को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। क्रिप्ट-रिलीज़िंग दर में सुधार करने के लिए, ईडीटीए के साथ उपचार के बाद जोरदार झटकों को शामिल करने वाली एक यांत्रिक अलगाव विधि स्थापित की गई थी। मध्यम रचना सातो एट अल.7 के मूल प्रोटोकॉल से अलग है। मूल माध्यम अपेक्षाकृत महंगा है। इस प्रकार, फार्माकोलॉजिकल इनहिबिटर, पुनः संयोजक विकास कारकों और / या वातानुकूलित मीडिया युक्त मुराइन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स के लिए एक संस्कृति माध्यम और अनुकूलित मीडिया तालिका 1 में दिखाया गया है। Wnt3A और N-एसिटाइलसिस्टीन इस प्रोटोकॉल में संस्कृति माध्यम में शामिल नहीं हैं। जैसा कि पनेथ कोशिकाएं डब्ल्यूएनटी 3 व्यक्त करती हैं, कोशिकाएं डब्ल्यूएनटी 3 का उत्पादन करती हैं और आईएससी रखरखाव का समर्थन करती हैं। इसके अतिरिक्त, क्रिप्ट अलगाव के दौरान, वातानुकूलित माध्यम का उपयोग नहीं किया जाता है। ऑर्गेनॉइड मॉडल गतिशील है और इसमें सेलुलर और संरचनात्मक विषमता (पनेथ कोशिकाएं, एंटरोसाइट्स, गोब्लेट कोशिकाएं, एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं, टफ्ट कोशिकाएं और आईएससी) हैं। इसलिए, इन ऑर्गेनोइड्स का उपयोग ऑर्गेनॉइड जीव विज्ञान के मौलिक मुद्दों का अध्ययन करने के लिए पैमाने पर किया जा सकता है।
EphB2 ढाल वयस्क छोटी आंत 18 में क्रिप्ट-विलस अक्ष के साथ आईएससी स्टेमनेस और प्रसार को बनाएरखता है। पृथक क्रिप्ट्स की तुलना में एक एकल एएफबी 2 सेल से ऑर्गेनोइड बनाने का लाभ मुराइन आईएससी के जीव विज्ञान को समझने से संबंधित है, क्योंकि आईएससी विभिन्न मानव आंतों के विकारों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एकल EphB2उच्च-व्यक्त करने वाले ISCs को एकल Lgr5-व्यक्त ISCs से ऑर्गेनोइड्स के विकास के समान तरीके से ऑर्गेनोइड बनाने के लिए संवर्धित किया जा सकता है। एफएसीएस का उपयोग करके क्रिप्ट्स में ईपीबी 2 अभिव्यक्ति के अनुसार कोशिकाओं को चार समूहों (EphB2उच्च, EphB2med, EphB2कम, और EphB2neg) में सटीक रूप से विभाजित करना है। फॉरवर्ड बनाम साइड स्कैटर (एफएससी बनाम एसएससी) प्लॉट आमतौर पर उनके आकार और ग्रैन्यूलैरिटी के आधार पर रुचि की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। एफएससी सेल आकार को इंगित करता है, और एसएससी पी 0 गेट (चित्रा 2 ए) में सेल की जटिलता या ग्रैन्यूलैरिटी से संबंधित है। इस काम में, परिभाषित गेट (पी 0) के भीतर गिरने वाली कोशिकाओं को बाद में व्यवहार्यता के लिए विश्लेषण किया गया था। इसके बाद, उनकी व्यवहार्यता 7-एएडी प्रतिदीप्ति संकेतों की नकारात्मक और सकारात्मक आबादी के अनुसार निर्धारित की गई थी। 7-एएडी-नकारात्मक और -सकारात्मक कोशिकाओं के बीच की सीमा को न्यूनतम सकारात्मक सेल संदूषण के साथ नकारात्मक लोगों को प्राप्त करने के लिए सख्ती से निर्णय लिया गया था। EphB2 गेट मोटे तौर पर EphB2 वर्गीकृत अभिव्यक्ति के आधार पर सेट किए गए थे।
यह पुष्टि करने के लिए कि चार समूहों को ठीक से विभाजित किया गया था, चयनित जीनों की एमआरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था। आईएससी मार्करों के एमआरएनए स्तर एएफबी 2 उच्च कोशिकाओं20 मेंउच्च हैं। इसके अतिरिक्त, पूर्वज सेल-विशिष्ट मार्करों के एमआरएनए स्तर एफबी 2मेड कोशिकाओं20 में अपेक्षाकृत अधिक हैं। हालांकि, EphB2कम और EphB2neg कोशिकाओं में EphB2 एक्सडप्रेशन EphB2उच्च और EphB2मेड कोशिकाओं20 की तुलना में कम या नकारात्मक है। चढ़ाना से पहले EphB2उच्च सेल आबादी के संवर्धन को सुनिश्चित करने के लिए पूर्ववर्ती उपाय किए जाने चाहिए। हालांकि, एएफबी 2उच्च कोशिकाओं से 6% से कम की ऑर्गेनॉइड वृद्धि संस्कृति प्रक्रिया के दौरान स्टेम कोशिकाओं की मृत्यु के कारण हो सकती है, न कि क्रिप्ट अलगाव के दौरान जोरदार झटके। यह दिखाया गया है कि मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए एक चयनात्मक Rho-संबद्ध किनेज (ROCK) अवरोधक का आवेदन स्पष्ट रूप से पृथक्करण-प्रेरित एपोप्टोसिस22 को कम करता है। इस प्रकार, एक तकनीकी परिवर्तन के रूप में, व्यवहार्यता में सुधार के लिए रॉक अवरोधक को उच्च एकाग्रता पर और लंबे समय तक इनक्यूबेशन के साथ जोड़ने की कोशिश करना उचित है।
आईएससी के बगल में डब्ल्यूएनटी 3 ए-स्रावित पनेथ कोशिकाएं आईएससी 8 को आवश्यक सहायता प्रदान करतीहैं। दरअसल, आईएससी-पेनेथ सेल डबल्स एकल आईएससी8 की तुलना में एक मजबूत बढ़ी हुई ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, संस्कृति के पहले 3 दिनों के लिए 100 एनजी / एमएल की एकाग्रता पर डब्ल्यूएनटी 3 ए को जोड़ने से ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता8 में वृद्धि हुई है। इस प्रकार, एक और तकनीकी परिवर्तन के रूप में, बहिर्जात WNT3A को जोड़ने से एकल EphB2उच्च-व्यक्त आईएससी की ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता में सुधार हो सकता है।
विवो दृष्टिकोण की तुलना में, ऑर्गेनोइड्स का उपयोग आनुवंशिक हेरफेर, घातक फेनोटाइप के विश्लेषण और दवा स्क्रीनिंग20,23 के लिए आसानी से किया जा सकता है। ईडीटीए चेलेशन और एक यांत्रिक अलगाव विधि का एक संयोजन क्रिप्ट से छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड बनाने के लिए प्रभावी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और समय-कुशल है और किसी भी उन्नत अनुभव के बिना प्रयोगशाला कर्मचारियों द्वारा आसानी से पालन किया जा सकता है। इस प्रकार, ईडीटीए के साथ उपचार के बाद जोरदार झटकों के साथ यांत्रिक अलगाव के अलावा कुशलतापूर्वक मुराइन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स एक्स विवो स्थापित कर सकते हैं और अन्य वयस्क उपकला ऊतकों के ऑर्गेनोइड खेती और रोग मॉडलिंग के लिए एक संभावित उपकरण प्रदान कर सकते हैं।
आंतों के उपकला कोशिकाओं को ध्रुवीकृत किया जाता है और लुमेन की ओर निर्देशित एपिकल पक्ष के साथ केंद्रित किया जाता है। हालांकि, 3 डी ऑर्गेनोइड्स के लुमेन का सामना करने वाला एपिकल पक्ष उनके इंटीरियर में है। इस प्रकार, यह संगठन एपिकल पक्ष तक पहुंच को रोकता है, जो उपकला कोशिकाओं पर पोषक तत्वों, रोगाणुओं और मेटाबोलाइट्स जैसे ल्यूमिनल घटकों के प्रभावों का अध्ययन करते समय एक मुद्दा है। इस नुकसान को दरकिनार करने के लिए, 2 डी मोनोलेयर के रूप में ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं की एकसंस्कृति विकसित की गई है। भविष्य के अनुप्रयोगों के संदर्भ में, ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर की संस्कृति का उपयोग किया जाएगा, क्योंकि यह सबसे कुशल और वापस लेने योग्य प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है।
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को टीटी (अनुदान संख्या जेपी 17 के07495 और जेपी 20के06751) के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान (सी) के लिए सहायता अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम दीर्घकालिक टाइम-लैप्स इमेजिंग (एलसीवी 100) के लिए उपकरणों के उपयोग के लिए प्रोफेसर मिनको केंगाकू को धन्यवाद देते हैं; ओलंपस)।
1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |