I denne artikel beskrives en protokol for manuel tyramidsignalforstærkning (TSA) multiplex immunofluorescens (mIF) kombineret med billedanalyse og rumlig analyse. Denne protokol kan bruges med formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) sektioner til farvning af to til seks antigener pr. dias afhængigt af den diasscanner, der er tilgængelig i laboratoriet.
Tumormikromiljøet (TME) består af en overflod af forskellige celletyper, såsom cytotoksiske immunceller og immunmodulerende celler. Afhængigt af dets sammensætning og interaktionerne mellem kræftceller og peritumorale celler kan TME påvirke kræftprogressionen. Karakteriseringen af tumorer og deres komplekse mikromiljø kan forbedre forståelsen af kræftsygdomme og kan hjælpe forskere og klinikere med at opdage nye biomarkører.
Vi har for nylig udviklet flere multiplex immunofluorescens (mIF) paneler baseret på tyramid signal amplifikation (TSA) til karakterisering af TME i kolorektal cancer, hoved og hals pladecellekarcinom, melanom og lungekræft. Når farvningen og scanningen af de tilsvarende paneler er afsluttet, analyseres prøverne på en billedanalysesoftware. Den rumlige position og farvningen af hver celle eksporteres derefter fra denne kvantificeringssoftware til R. Vi udviklede R-scripts, der giver os mulighed for ikke kun at analysere tætheden af hver celletype i flere tumorrum (f.eks. tumorens centrum, tumorens margen og stroma), men også at udføre afstandsbaserede analyser mellem forskellige celletyper.
Denne særlige arbejdsgang tilføjer en rumlig dimension til den klassiske tæthedsanalyse, der allerede rutinemæssigt udføres for flere markører. mIF-analyse kunne give forskere mulighed for at få en bedre forståelse af det komplekse samspil mellem kræftceller og TME og opdage nye prædiktive biomarkører for respons på behandlinger, såsom immuncheckpointhæmmere og målrettede terapier.
Med udviklingen af målrettede terapier og immuncheckpointhæmmere er det blevet yderst vigtigt at karakterisere interaktionerne mellem kræftceller og deres tumormikromiljø bedre, og dette er i øjeblikket et vigtigt felt inden for translationel forskning. TME består af en overflod af forskellige celletyper med en balance mellem immuncytotoksiske celler rettet mod kræftcellerne og immunmodulerende celler, der kan favorisere tumorvækst og invasivitet 1,2,3,4. Karakteriseringen af dette komplekse miljø kan forbedre forståelsen af kræftsygdomme og kan hjælpe forskere og klinikere med at opdage nye prædiktive og prognostiske biomarkører for bedre at kunne vælge patienter til fremtidig behandling 5,6. For eksempel udviklede Galon og hans team Immunoscore, som er en reproducerbar scoringsmetode, der kan bruges som en prædiktiv biomarkør. Immunoscoren beregnes ved hjælp af densiteten af CD3+ og CD8+ T-celler i den invasive margen og i midten af tumoren 7,8.
I løbet af de sidste årtier er der udviklet kommercielle løsninger til mIF, men disse er ofte dyre og designet til specifikke antigenpaneler. For at overvinde behovet for specifikke paneler af antigener i akademisk og translationel forskning udviklede vi en omkostningseffektiv metode til at udføre mIF på FFPE-tumorsektioner, hvilket tillod farvning af to til seks antigener tilsat cellekernerne modfarvning på humane prøver og museprøver.
Når hele vævssektionerne er farvet og scannet med en fluorescensdiasscanner, kan prøverne analyseres af flere billedanalysesoftware, der understøtter store pyramidale datasæt. Endelig kan rådataene bruges i et miljø til statistisk databehandling og grafik som R-softwaren (v.4.0.2) for at udføre densitets- og rumbaserede analyser.
En protokol optimeret til fem-markørfarvning samt tricks og tip til optimering af nye paneler præsenteres i dette manuskript. Desuden forklares detaljerede trin i billedanalysen og R-funktionerne, der anvendes til den statistiske og rumlige analyse.
De vigtigste parametre, der skal tages i betragtning for at optimere multiplexfarvning, er fortyndingen, specificiteten og antigenhentningen, der anvendes til hvert primært antistof. Før du starter en multiplexprotokol, skal hvert primært antistofs optimale fortynding og optimale epitophentning (pH 6 eller pH 9) testes ved hjælp af kromogen farvning (DAB). Vi anbefaler at teste tre fortyndinger for hver antigenhentningsbuffer: den fortynding, der normalt specificeres af mærket, der kommercialiserer antistoffet, den samme fortynding delt to gange og den samme fortynding multipliceret to gange (figur 8). Valg af den rigtige fortynding er et meget vigtigt skridt til at verificere antistofspecificiteten og optimere signal-støjforholdet (SNR) for farvningen. Efter valg af den rigtige fortynding i DAB skal den samme fortynding testes for hvert primært antistof ved anvendelse af uniplex TSA. Når fortyndings- og epitophentningsbufferen er valgt for hver antigenfarvning, er det også vigtigt at indstille multiplexsekvensen korrekt; Specifikt farves nogle antigener bedre i den første position og andre i den sidste position. Vi anbefaler at teste multiplexmærkningen ved hjælp af alle mulige ordrepermutationer for at vælge, hvilken antigenfarvning der skal komme først, anden osv. Dette er også et meget vigtigt skridt, fordi nogle skrøbelige antigener kan nedbrydes efter flere runder af epitophentning, og nogle antigener er bedre farvet efter flere runder af epitophentning. For eksempel er SNR altid højere i den sidste position for CD3 og i den første position for PD-1-farvning. Desuden kan farvningen af flere co-lokaliserede antigener hindres af en paraplyvirkning (mætning af tyramidrereaktive steder). Dette kan dæmpes ved at nedsætte tyramidkoncentrationen. Når ekspressionen af et antigen er betinget af ekspressionen af et andet (CD8 kun til stede på CD3-ekspressive T-celler), anbefaler vi farvning af antigenet med det bredeste udtryk (CD3 i dette tilfælde) efter det andet. Endelig er det også et vigtigt skridt at vælge den rigtige fluorochrom til hver antigenfarvning i henhold til scannerens specificiteter for at undgå krydsdetektion.
De største fordele ved denne teknik er forstærkningen og signal-støj-forholdet opnået. Denne teknik kommer dog med en begrænsning, som er, at farvningen er sekventiel, og fluorkromerne er kovalent bundet til vævet. Ikke desto mindre er det efter at have udført alle tyramidsignalforstærkningsrunder også muligt at tilføje en sidste farvning med et sekundært antistof direkte kombineret med en fluorochrom (ingen TSA). I nogle paneler brugte vi denne metode til at tilføje farvning i 750-kanalen. Dette var nødvendigt, fordi ingen tyramid-AF750 var kommercielt tilgængelig på det tidspunkt. Bemærk, at eksponeringstiden (under scanningen) af antigenet farvet med AF750 vil være meget længere end for de andre antigener, der er farvet med TSA. I så fald anbefaler vi farvning af et stærkt udtrykt protein, såsom cytokeratin eller forøgelse af koncentrationen af det primære antistof. Ved at gøre det er det muligt at plette maksimalt fem til seks antigener pr. dias i en batch afhængigt af fluorescensscanneren.
I modsætning hertil bruger flere kommercielt tilgængelige teknikker seriel farvning med flere runder farvning, scanning og stripping eller fotoblegning for at forbedre antallet af antigener, der kan farves på en enkelt vævssektion. Disse teknikker er dog ofte tidskrævende, dyre, har ingen signalforstærkning, kræver avancerede beregningstrin for at flette de serielle scanninger korrekt og kan efter vores erfaring fremkalde irreversibel vævsskade på grund af de mange proceduretrin. Ikke desto mindre er det blevet rapporteret, at op til 30 antigener kunne farves på et enkelt væv ved hjælp af denne metode14.
Afslutningsvis er vores metode en robust, reproducerbar, brugervenlig og omkostningseffektiv immunhistofluorescensteknik, der kan bruges i ethvert laboratorium, der har en fluorescensdiasscanner. Ethvert kommercialiseret primært antistof, der er egnet til IHC, kan anvendes, og panelerne er ikke specifikke for kommercielle sæt. Billedanalysen kan udføres på flere forskellige programmer, herunder open source-programmer som QuPath og R. Vi mener dog, at denne metode endda kan forbedres i fremtiden for store antigenpaneler, hvilket giver mulighed for at udføre seriel farvning/scanning af det samme dias med forskellige antigenpaneler og med fordelen ved signalforstærkning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Derouane F for hendes hjælp og støtte. Nicolas Huyghe er forsker støttet af et tilskud fra den belgiske nationale fond for videnskabelig forskning (Télévie/FNRS 7460918F).
anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
ATTO-425 | ATTOtec | ||
Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 – emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
HALO software | Indicalabs | ||
Hoescht | Sigma | 14533 | |
Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |