I denne artikkelen beskrives en protokoll for manuell tyramidsignalforsterkning (TSA) multiplex immunfluorescens (mIF) kombinert med bildeanalyse og romlig analyse. Denne protokollen kan brukes med formalinfaste parafin-innebygde (FFPE) seksjoner for farging av to til seks antigener per lysbilde, avhengig av lysbildeskanneren som er tilgjengelig i laboratoriet.
Tumormikromiljøet (TME) består av en mengde forskjellige celletyper, for eksempel cytotoksiske immunceller og immunmodulerende celler. Avhengig av sammensetningen og interaksjonene mellom kreftceller og peritumorale celler, kan TME påvirke kreftprogresjonen. Karakteriseringen av svulster og deres komplekse mikromiljø kan forbedre forståelsen av kreftsykdommer og kan hjelpe forskere og klinikere til å oppdage nye biomarkører.
Vi har nylig utviklet flere multiplex immunfluorescens (mIF) paneler basert på tyramid signalforsterkning (TSA) for karakterisering av TME i kolorektal kreft, hode og nakke plateepitelkarsinom, melanom og lungekreft. Når farging og skanning av de tilsvarende panelene er fullført, analyseres prøvene på en bildeanalyseprogramvare. Den romlige posisjonen og fargingen av hver celle eksporteres deretter fra denne kvantifiseringsprogramvaren til R. Vi utviklet R-skript som lar oss ikke bare analysere tettheten av hver celletype i flere tumorrom (f.eks. sentrum av svulsten, marginen til svulsten og stroma), men også å utføre avstandsbaserte analyser mellom forskjellige celletyper.
Denne spesielle arbeidsflyten gir en romlig dimensjon til den klassiske tetthetsanalysen som allerede rutinemessig utføres for flere markører. mIF-analyse kan tillate forskere å få en bedre forståelse av det komplekse samspillet mellom kreftceller og TME og å oppdage nye prediktive biomarkører for respons på behandlinger, for eksempel immunkontrollpunkthemmere og målrettede terapier.
Med utviklingen av målrettede terapier og immunkontrollpunkthemmere har det blitt av største betydning å bedre karakterisere samspillet mellom kreftceller og deres tumormikromiljø, og dette er for tiden et viktig felt for translasjonsforskning. TME består av en mengde forskjellige celletyper, med en balanse mellom immuncytotoksiske celler rettet mot kreftcellene og immunmodulerende celler som kan favorisere tumorvekst og invasivitet 1,2,3,4. Karakteriseringen av dette komplekse miljøet kan forbedre forståelsen av kreftsykdommer og kan hjelpe forskere og klinikere til å oppdage nye prediktive og prognostiske biomarkører for bedre å velge pasienter for fremtidig behandling 5,6. For eksempel utviklet Galon og hans team Immunoscore, som er en reproduserbar scoringsmetode som kan brukes som en prediktiv biomarkør. Immunoscore beregnes ved hjelp av tettheten av CD3+ og CD8+ T-celler i invasiv margin og i sentrum av tumor 7,8.
I løpet av de siste tiårene har kommersielle løsninger for mIF blitt utviklet, men disse er ofte dyre og designet for spesifikke paneler av antigener. For å overvinne behovet for spesifikke paneler av antigener i akademisk og translasjonsforskning, utviklet vi en kostnadseffektiv metode for å utføre mIF på FFPE-tumorseksjoner, slik at farging av to til seks antigener tilsatt cellekjernene motfarging på menneske- og museprøver.
Når hele vevsseksjonene er farget og skannet med en fluorescensglideskanner, kan prøvene analyseres av flere bildeanalyseprogrammer som støtter store pyramidale datasett. Til slutt kan rådataene brukes i et miljø for statistisk databehandling og grafikk som R-programvaren (v.4.0.2) for å utføre tetthets- og rombaserte analyser.
En protokoll optimalisert for farging med fem markører, samt triks og tips for å optimalisere nye paneler, presenteres i dette manuskriptet. Videre forklares detaljerte trinn i bildeanalysen og R-funksjonene som brukes til statistisk og romlig analyse.
De viktigste parametrene å ta hensyn til for å optimalisere multipleksfarging er fortynningen, spesifisiteten og antigengjenfinningen som brukes for hvert primære antistoff. Før du starter en multipleksprotokoll, må hvert primære antistoffs optimale fortynning og optimale epitoputhenting (pH 6 eller pH 9) testes ved bruk av kromogen farging (DAB). Vi anbefaler å teste tre fortynninger for hver antigenuthentingsbuffer: fortynningen som vanligvis spesifiseres av merket som kommersialiserer antistoffet, den samme fortynningen delt to ganger, og den samme fortynningen multiplisert to ganger (figur 8). Å velge riktig fortynning er et svært viktig skritt for å verifisere antistoffspesifisiteten og optimalisere signal-støy-forholdet (SNR) til fargingen. Etter å ha valgt riktig fortynning i DAB, bør den samme fortynningen testes for hvert primære antistoff ved bruk av uniplex TSA. Når fortynnings- og epitophentingsbufferen er valgt for hver antigenfarging, er det også viktig å sette opp sekvensen av multiplekset riktig. Spesielt er noen antigener bedre farget ved den første posisjonen og andre i den siste posisjonen. Vi anbefaler å teste multipleksmerkingen med alle mulige rekkefølgepermutasjoner for å velge hvilken antigenfarging som skal komme først, andre osv. Dette er også et svært viktig skritt fordi noen skjøre antigener kan brytes ned etter flere runder med epitoputhenting, og noen antigener er bedre farget etter flere runder med epitopgjenfinning. For eksempel er SNR alltid høyere i den siste posisjonen for CD3 og i den første posisjonen for PD-1-farging. Videre kan fargingen av flere samlokaliserte antigener hindres av en paraplyeffekt (metning av tyramidreaktive steder). Dette kan dempes ved å redusere tyramidkonsentrasjonen. Når ekspresjonen av ett antigen er betinget av ekspresjonen av et annet (CD8 finnes bare på CD3-uttrykkende T-celler), anbefaler vi å farge antigenet med det bredeste uttrykket (CD3 i dette tilfellet) etter det andre. Til slutt er det også et viktig skritt å velge riktig fluorokrom for hver antigenfarging i henhold til skannerens spesifikasjoner for å unngå kryssdeteksjon.
De største fordelene med denne teknikken er forsterkningen og signal-støy-forholdet som er oppnådd. Imidlertid kommer denne teknikken med en begrensning, som er at fargingen er sekvensiell, og fluorokromene er kovalent bundet til vevet. Likevel, etter å ha utført alle tyramidsignalforsterkningsrundene, er det også mulig å legge til en siste farging med et sekundært antistoff direkte koblet til et fluorokrom (ingen TSA). I noen paneler brukte vi denne metoden for å legge til farging i 750-kanalen. Dette var nødvendig fordi ingen tyramid-AF750 var kommersielt tilgjengelig på den tiden. Merk at eksponeringstiden (under skanningen) av antigenet farget med AF750 vil være mye lengre enn for de andre antigenene farget med TSA. I så fall anbefaler vi å farge et høyt uttrykt protein som cytokeratin eller øke konsentrasjonen av det primære antistoffet. Ved å gjøre det er det mulig å flekke maksimalt fem til seks antigener per lysbilde i en batch, avhengig av fluorescensskanneren.
I opposisjon bruker flere kommersielt tilgjengelige teknikker seriefarging med flere runder med farging, skanning og stripping eller fotobleking for å forbedre antall antigener som kan farges på en enkelt vevsseksjon. Imidlertid er disse teknikkene ofte tidkrevende, dyre, har ingen signalforsterkning, krever avanserte beregningstrinn for å slå sammen serielle skanninger riktig, og kan etter vår erfaring indusere irreversibel vevsskade på grunn av de mange prosedyretrinnene. Likevel har det blitt rapportert at opptil 30 antigener kan farges på ett enkelt vev ved hjelp av denne metoden14.
Avslutningsvis er metoden vår en robust, reproduserbar, brukervennlig og kostnadseffektiv immunhistofluorescensteknikk som kan brukes i ethvert laboratorium som har en fluorescensglideskanner. Ethvert kommersialisert primært antistoff egnet for IHC kan brukes, og panelene er ikke spesifikke for noen kommersielle sett. Bildeanalysen kan gjøres på flere forskjellige programmer, inkludert åpen kildekode-programmer som QuPath og R. Vi tror imidlertid at denne metoden til og med kan forbedres i fremtiden for store antigenpaneler, noe som gjør det mulig å utføre seriell farging / skanning av det samme lysbildet med forskjellige paneler av antigener og med fordelen av signalforsterkning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Derouane F for hennes hjelp og støtte. Nicolas Huyghe er stipendiat støttet av et stipend fra Belgian National Fund for Scientific Research (Télévie/FNRS 7460918F).
anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
ATTO-425 | ATTOtec | ||
Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 – emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
HALO software | Indicalabs | ||
Hoescht | Sigma | 14533 | |
Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |