Her beskriver vi et mikrodrevdesign, kirurgisk implantationsprocedure og postkirurgisk genopretningsstrategi, der giver mulighed for kronisk felt- og enkeltenhedsoptagelser fra flere hjerneområder samtidigt i unge og unge mus på tværs af et kritisk udviklingsvindue fra postnatal dag 20 (p20) til postnatal dag 60 (p60) og derefter.
In vivo elektrofysiologi giver uovertruffen indsigt i kredsløbsdynamikken på sub-sekund-niveau i den intakte hjerne og repræsenterer en metode af særlig betydning for at studere musemodeller af menneskelige neuropsykiatriske lidelser. Sådanne metoder kræver imidlertid ofte store kranieimplantater, som ikke kan anvendes til mus på tidlige udviklingstidspunkter. Som sådan er der stort set ingen undersøgelser af in vivo-fysiologi blevet udført i frit opførte spædbarn eller unge mus, på trods af at en bedre forståelse af neurologisk udvikling i dette kritiske vindue sandsynligvis ville give unik indsigt i aldersafhængige udviklingsforstyrrelser som autisme eller skizofreni. Her beskrives et mikrodrevdesign, kirurgisk implantationsprocedure og postkirurgisk genopretningsstrategi, der giver mulighed for kronisk felt- og enkeltenhedsoptagelser fra flere hjerneområder samtidigt hos mus, når de ældes fra postnatal dag 20 (p20) til postnatal dag 60 (p60) og derover, et tidsvindue, der stort set svarer til menneskets alder fra 2 år til voksenalderen. Antallet af registreringselektroder og endelige registreringssteder kan let ændres og udvides, hvilket muliggør fleksibel eksperimentel kontrol af in vivo-overvågning af adfærds- eller sygdomsrelevante hjerneområder på tværs af udvikling.
Hjernen gennemgår store ændringer i løbet af de kritiske udviklingsvinduer i barndommen og ungdommen 1,2,3. Mange neurologiske og psykiatriske sygdomme, herunder autisme og skizofreni, manifesterer sig først adfærdsmæssigt og biologisk i denne periode med ungdoms- og ungdomshjerneudvikling 4,5,6. Mens meget er kendt om de cellulære, synaptiske og genetiske ændringer, der opstår på tværs af tidlig udvikling, er forholdsvis lidt kendt om, hvordan kredsløbs- eller netværksniveauprocesser ændrer sig i løbet af dette tidsvindue. Det er vigtigt, at hjernefunktion på kredsløbsniveau, som i sidste ende ligger til grund for kompleks adfærd, hukommelse og kognition, er en ikke-forudsigelig, fremvoksende egenskab ved cellulær og synaptisk funktion 7,8,9,10. For fuldt ud at forstå hjernefunktionen på netværksniveau er det således nødvendigt direkte at studere neural aktivitet på niveau med et intakt neuralt kredsløb. For at identificere, hvordan hjerneaktiviteten ændres gennem udviklingen af neuropsykiatriske lidelser, er det desuden afgørende at undersøge netværksaktivitet i en gyldig sygdomsmodel i det specifikke tidsmæssige vindue, når sygdommens adfærdsmæssige fænotyper manifesterer sig og spore de observerede ændringer, når de fortsætter ind i voksenalderen.
En af de mest almindelige og kraftfulde videnskabelige modelorganismer er musen med et stort antal unikke genetiske stammer, der modellerer neuroudviklingsforstyrrelser med aldersafhængig debut af adfærdsmæssige og / eller mnemoniske fænotyper 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Selvom det er udfordrende at korrelere præcise udviklingstidspunkter mellem hjernen hos mennesker og mus, indikerer morfologiske og adfærdsmæssige sammenligninger, at p20-p21-mus repræsenterer de menneskelige aldre 2-3 år, og p25-p35-mus repræsenterer de menneskelige aldre 11-14 år, hvor mus sandsynligvis når udviklingsækvivalenten til en menneskelig 20-årig voksen med p603, 22. For bedre at forstå, hvordan den unge hjerne udvikler sig og for at identificere, hvordan hjernens neurale netværk bliver dysfunktionelle i sygdomme som autisme eller skizofreni, ville det være ideelt at overvåge hjerneaktivitet in vivo direkte hos mus i alderen 20 dage til 60 dage gamle.
En grundlæggende udfordring ved overvågning af hjerneaktivitet på tværs af tidlig udvikling hos mus er imidlertid den lille størrelse og relative svaghed hos unge mus. Den kroniske implantation af elektroder, som er nødvendig for langsgående undersøgelser af hjernens udvikling, kræver typisk store, omfangsrige huse for at beskytte de fine elektrodetråde og interfacekort23,24, og implantaterne skal være fast fastgjort til musekraniet, som er tyndere og mindre stift hos unge mus på grund af reduceret ossifikation. Således er stort set alle undersøgelser af in vivo gnaverfysiologi blevet udført hos voksne forsøgspersoner på grund af deres relative størrelse, styrke og kranietykkelse. Til dato er de fleste undersøgelser, der udforsker in vivo juvenil gnaverhjernefysiologi, blevet udført i vildtype unge rotter, hvilket nødvendigvis begrænser evnen til eksperimentelt at overvåge juvenil hjernefunktion i en frit opførte model af en menneskelig lidelse 25,26,27,28,29,30.
Dette manuskript beskriver nyt implantathus, en kirurgisk implantationsprocedure og en postoperativ genopretningsstrategi til kronisk undersøgelse af den langsigtede (op til 4 eller flere uger) in vivo-hjernefunktion hos unge mus over et udviklingskritisk tidsvindue (p20 til p60 og derover). Implantationsproceduren muliggør pålidelig, permanent fastgørelse af elektroderne til kranierne hos unge mus. Desuden er mikrodrevdesignet let, da dette mikrodrev vejer ~ 4-6 g, når det er fuldt samlet, og på grund af den minimale modvægt, der kræves for at kompensere implantatets vægt, påvirker det ikke adfærdspræstationen hos unge mus under typiske adfærdsparadigmer.
Moderne eksperimenter, der udforsker in vivo neurale kredsløbsfunktion hos gnavere, bruger ofte ekstracellulær elektrofysiologi via permanent implanterede elektroder til at overvåge aktiviteten af individuelle neuroner (dvs. enkeltenheder) eller lokale populationer (via lokale feltpotentialer, LFP), men sådanne metoder anvendes sjældent på unge mus på grund af tekniske udfordringer. Dette manuskript beskriver en metode til opnåelse af in vivo elektrofysiologiske optagelser i mus på tværs af de udviklingskritiske vinduer i p20 til p60 og derover. Denne metode involverer en fremstillingsproces til udskrivning og konstruktion af et mikrodrevimplantat, en kirurgisk implantationsprocedure og en postoperativ genopretningsstrategi, som alle er specielt skræddersyet til brug i unge mus. Flere overvejelser var indflydelsesrige i udviklingen af denne protokol, herunder den lille størrelse og relative svaghed hos unge mus sammenlignet med deres voksne kolleger, samt den reducerede ossifikation af det unge musekranium, som mikrodrevet skulle fastgøres på.
To primære metoder, der almindeligvis anvendes til at udføre in vivo elektrofysiologi, er arrays af elektroder (fx tetroder) og siliciumprober. Siliciumsonder er lette, kan give et stort antal registreringssteder pr. vægtenhed og er tidligere blevet brugt til unge rotter25. Siliciumsonder er dog relativt dyre pr. Enhed. I modsætning hertil kan mikrodrevet, der er beskrevet i dette manuskript, konstrueres ved hjælp af mindre end $ 50 USD i råmaterialer, hvilket gør det til en omkostningseffektiv mulighed for in vivo-optagelse. Derudover skal siliciumprober ofte implanteres i faste linjer, hvilket forbyder optagelse af rumligt forskellige hjerneområder. I modsætning hertil anvender mikrodrevdesignet beskrevet i dette manuskript uafhængigt justerbare tetroder til at rumme samtidige optagelser på op til 16 forskellige steder med praktisk talt ingen begrænsning af det rumlige forhold mellem disse steder. Dette mikrodrevdesign kan nemt ændres, så det bliver muligt at målrette mod andre placeringer end dem, der er beskrevet her, ved at flytte kanylehullets ekstrudering til enhver ønsket anterior/posterior og medial/distal placering. Når man målretter mod alternative hjerneområder, er det vigtigt at bemærke, at mens tetroderne ofte vil rejse lige, er det muligt for disse tynde ledninger at afbøje lidt, når de forlader mikrodrevkanylen. Jo mindre eller mere ventral en hjerneregion er, jo mere udfordrende vil det være at målrette området med tetroder.
Mikrodrevimplantatet, der er beskrevet i dette manuskript, ligner grundlæggende flere tidligere tetrodebaserede mikrodrevdesign 23,32,33,34,35, idet de enkelte tetroder er fastgjort til skruer, som muliggør fin kontrol af optagedybden for hver tetrode. Mens flere funktioner i det nuværende mikrodrevdesign er unikke, herunder den lette målretning af rumligt distribuerede hjerneområder, er den primære nyhed i det nuværende manuskript beskrivelsen af kirurgiske implantations- og postkirurgiske genopretningsstrategier, som giver mulighed for kroniske undersøgelser af netværksaktivitet hos stadig udviklende unge mus. Faktisk kunne de kirurgiske og restitutionsmetoder, der er beskrevet her, tilpasses til at understøtte andre implantater i unge mus.
For at opretholde en ensartet optagelse over flere dage skal ledningerne eller sonderne være stift fastgjort til kraniet. Mens musekraniets overordnede struktur kun gennemgår mindre ændringer efter p20, tykner kraniet betydeligt mellem alderen p20 og p4536. Faktisk er kraniet ved p20 ikke tilstrækkeligt stift til at understøtte et vedhæftet implantat uden at blive beskadiget. For at overvinde denne biologiske begrænsning fortykker denne protokol kunstigt kraniet via cyanoacrylat under implantationsoperationen. Implantation i mus yngre end p20 er sandsynligvis mulig ved hjælp af denne strategi, men musekraniet gennemgår betydelige størrelses- og formændringer indtil ca. p2036. Således anbefales implantation i længere perioder hos mus yngre end p20 ikke, da cyanoacrylatet og faste knogleskruer i det stadig udviklende kranium kan påvirke kraniets naturlige vækst og den underliggende hjernevævsudvikling betydeligt. Det er vigtigt, at der i denne undersøgelse ikke blev observeret nogen indvirkning på de grove målinger af kraniet eller hjernestørrelsen efter kronisk implantation startende ved p20 (figur 5C).
Et kritisk trin i metoden beskrevet i dette manuskript er genopretningsstrategien efter operationen; Ifølge denne strategi skal implantatets vægt kontinuerligt udlignes, efterhånden som musen modnes og gennemgår muskel- og muskuloskeletalsystemudvikling. Tidligt efter implantationen er mus ikke i stand til at bære implantatets vægt uden modvægten, hvilket fører til underernæring og dehydrering, da musen ikke i tilstrækkelig grad kan nå føde- og vandkilderne i sit bur. Modvægtssystemet er let og billigt at konstruere, trivielt at implementere og giver mus i enhver implanterbar alder mulighed for frit at udforske hele deres hjemmebur og dermed sikre tilstrækkelig ernæring og hydrering. Når mus bliver ældre, kan mængden af modvægt mindskes, indtil den helt kan fjernes hos voksne mus; Imidlertid anbefales fortsat anvendelse af modvægtssystemet i eksperimentets varighed med mindst en nominel modvægt knyttet til enhver tid. Mens en voksen mus kan være i stand til at bære mikrodrevets størrelse og vægt over tid, producerer fortsat naturlig bevægelse under fri adfærd uden forbedrende modvægt drejningsmoment og skærekraft på knogleskruerne, der forankrer mikrodrevet på kraniet, hvilket gør det mere og mere sandsynligt, at det løsner sig, især under længere kroniske eksperimenter.
To vigtige begrænsninger er værd at bemærke for den aktuelle undersøgelse. For det første blev flere kohorter af mus ofret efter langvarig implantation (figur 5C) for at vurdere virkningen af implantation ved p20 på kraniet og hjernens udvikling (figur 5C). Mens disse analyser ikke afslørede nogen signifikant indvirkning af implantation på kraniehulens størrelse eller hjernemasse (figur 5C), undersøgte den aktuelle undersøgelse ikke kraniestørrelsen eller hjernemassen på flere tidspunkter i hele den tidlige udviklingsperiode af p20-p60. Mens tidligere arbejde viser, at udviklingen af hjernehulen er afsluttet med p2036, er det muligt, at implantation i dette tidlige vindue kan producere uventede ændringer, der korrigeres eller kompenseres af de voksne aldre, der blev evalueret her. For det andet var eksperimenterne, der producerede de elektrofysiologiske data vist i figur 3 og figur 4 , ikke designet til at maksimere celleudbyttet. Mens de data, der præsenteres her, viser stabile, kroniske optagelser og velisolerede enkeltenheder, bør de således ikke tages som repræsentative for det maksimale potentielle udbytte for denne enhed.
Mange menneskelige neurologiske og psykiatriske lidelser manifesterer sig i perioder med tidlig udvikling eller på tværs af ungdomsårene, herunder autisme og skizofreni. Imidlertid er der lidt kendt om dysfunktion på kredsløbsniveau, der kan ligge til grund for disse sygdomme, på trods af den overflod af tilgængelige musemodeller. Identifikationen af disse indledende netværksændringer er afgørende for at skabe tidlige påvisningsstrategier og behandlingsparadigmer. På grund af tekniske udfordringer er det dog stadig uklart, hvordan netværksfunktionen forstyrres på tværs af udviklingen i musemodeller af neuropsykiatriske sygdomme. Den mikrodrevs- og genopretningsstrategi, der beskrives her, er designet til at understøtte undersøgelser af multiregional hjernenetværksudvikling i musehjernen og dermed give forskere mulighed for at måle sund hjerneudvikling samt identificere ændringer i denne udvikling i musemodeller for sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) og F99NS12053 (L.D.Q.) og UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. og L.D.Q.). Forfatterne takker Jenny Scaria (Texas Tech University Health Sciences Center School of Pharmacy) for teknisk assistance og Dr. Brendon Watson (University of Michigan) for metodologiske forslag.
10 V video tracking LEDs | Neuralynx | HS-LED-Red/Green-omni-10V | For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes |
16TT EIB Board | Neuralynx | EIB-36-16TT | Electronic interface board- omnetics connector |
16TT headstage pre-amplifier | Neuralynx | HS-36-LED | Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes |
Baby-Mixter hemostat | FST | 13013-14 | Fine curved hemostat |
Bone anchor screw | Stoelting | 51457 | Used to attach EIB board to main drive body |
Burpenorphine | ZooPharm | Lot #BERLAB0.5-221207 | Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity |
Cable tether | Neuralynx | HS-36 Litz Tether | Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m |
Carprofen/Rimadyl | Bio-Serve | MD150-2 | Post-operative anti-inflammatory agent |
Clear resin v4 | Formlabs | FLGPGR04 | Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process |
Custom (shuttle) screw | Advanced Machining and Tooling, Inc. | Custom | Machined and threaded custom screws |
Dental acrylic liquid component | Teets denture material | Lot# 329801 | liquid component of denture material (see above) |
Dental acrylic powder component | Teets denture material | Lot# 583987 | "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place |
DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | High calorie dietary supplement for young/recovering mice |
Digital Lynx 16SX | Neuralynx | DigitalLynx 16SX Base | Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels |
Dissector scissors- heavy blades | FST | 14082-09 | Various |
Dumont #5 ceramic coated forceps | FST | 11252-50 | Tetrode handling/threading/pinning |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose assembly use |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose surgical use |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Various |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Multipurpose surgical use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Plating/assembly use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery |
Euthasol | Virbac | 710101 | Pentobarbital sodium for euthanasia |
Extra fine Bonn scissors | FST | 14083-38 | Various |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Fine hemostats | FST | 13006-12 | Fine hemostats |
Fine scissors- CeramaCut | FST | 14958-09 | Tetrode cutting |
Fine scissors- ToughCut | FST | 14058-09 | Various |
Form 3+ | Formlabs | PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC | 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS) |
Gel super glue | Loctite | 1363589 | Various steps |
Graefe forceps | FST | 11049-10 | Small angled serrated forceps |
Ground wire | A-M Systems | Lot# 582335 | Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet |
Hair removal gel | Generic | Commercially available | For pre-op removal of hair from top of mouse head |
Heat gun | Dewalt | D26960K | Tetrode fusion following spinning |
High temperature cautery kit | FST | 18010-00 | For use with bone wax if applicable |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures |
Isoflurane | Covetrus | 11695067771 | Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5% |
Isopropyl alcohol 91% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) | Component supply co. | MX-000120-02SFL | S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive |
LaGrange scissors | FST | 14173-12 | Various |
Large polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 13564 | Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36" |
Liquid super glue | Loctite | 1365882 | Various steps |
Micro drill | Foredom | K.1070 | K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use |
Micro drill burr (0.5 mm+) | FST | 19007-05/07/09 | Craniotomy |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | Various steps |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | For use keeping craniotomy holes open |
Miniature flathead screwdriver | FST | 30051-10 | Insertion/tightening of bone screws |
Neosporin Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 512373700 | Antibiotic ointment |
Omnetics 44 socket nano connector | Neuralynx | Neuralynx part #A70427-801 | NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus |
Platinum 10% iridium wire | California fine wire | MO# M374710 | Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT |
Platinum black plating solution | Neuralynx | Platinum black plating solution | Plating |
Polycarbonate cage bottom | Thomas Scientific/Maryland plastics | 1113M35; mfr. No. E0270 | Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice |
Polycarbonate cage top with N10 micro filter | Ancare | N/A | Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus |
Povidone iodine 10% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
PVC pipe | Charlotte pipe | N/A | 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery |
Scalpel blades- #4 | FST | 10060-00 | Incision use |
Scalpel handle- #4 gross anatomy | FST | 10060-13 | Incision use |
Self-holding pin and bone screw forceps | FST | 26100-00 | Holder for bone and ground screws while inserting into skull |
Small EIB pins | Neuralynx | Small EIB pins | Attachment of tetrode wires to EIB board |
Small polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 19102423 | Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36" |
SolidWorks | Dassault Systemes | SolidWorks | 3D CAD program for micro-drive design |
Spatula and probe | FST | 1090-13 | Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Scissors for cranial tissue incisions |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Initial incisions |
Standard pattern forceps | FST | 11000-12 | Large serrated forceps |
Surgical scissors- sharp-blunt | FST | 14001-12 | Various |
Surgical scissors- ToughCut | FST | 14054-13 | Various |
Tetrode assembly station | Neuralynx | Tetrode assembly station | Tetrode Assembly |
Tetrode spinner 2.0 | Neuralynx | Tetrode spinner 2.0 | Tetrode Assembly |
Two-part epoxy | Gorilla brand | 4200102 | Various steps |