ताजे ऊतक से अग्नाशय ी कैंसर-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स और फाइब्रोब्लास्ट ्स की स्थापना
Summary
ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स ने कैंसर अनुसंधान और व्यक्तिगत चिकित्सा के दृष्टिकोण में क्रांति ला दी है। वे एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक ट्यूमर मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं जो शोधकर्ताओं को क्लिनिक में ट्यूमर से एक कदम आगे रहने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल ताजे अग्नाशय ी ट्यूमर ऊतक के नमूनों और अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा मूल के रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स से ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स स्थापित करता है।
Abstract
ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स त्रि-आयामी (3 डी) एक्स विवो ट्यूमर मॉडल हैं जो मूल प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों की जैविक प्रमुख विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करते हैं। रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स का उपयोग ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान में किया गया है और इसे उपचार संवेदनशीलता और प्रतिरोध, सेल-सेल इंटरैक्शन और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ ट्यूमर सेल इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स जटिल संस्कृति प्रणालियां हैं जिन्हें विशिष्ट विकास कारक कॉकटेल और एक जैविक तहखाने झिल्ली के साथ उन्नत सेल कल्चर तकनीकों और संस्कृति मीडिया की आवश्यकता होती है जो बाह्य वातावरण की नकल करती है। प्राथमिक ट्यूमर संस्कृतियों को स्थापित करने की क्षमता अत्यधिक उत्पत्ति के ऊतक, सेलुलरिटी और ट्यूमर की नैदानिक विशेषताओं पर निर्भर करती है, जैसे कि ट्यूमर ग्रेड। इसके अलावा, ऊतक नमूना संग्रह, सामग्री की गुणवत्ता और मात्रा, साथ ही सही बायोबैंकिंग और भंडारण इस प्रक्रिया के महत्वपूर्ण तत्व हैं। प्रयोगशाला की तकनीकी क्षमताएं भी विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। यहां, हम एक मान्य एसओपी / प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं जो अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा मूल के ताजा ऊतक नमूनों से एक्स विवो ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति के लिए तकनीकी और आर्थिक रूप से संभव है, या तो ताजा प्राथमिक रोगी दाता ऊतक या रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) से। यहां वर्णित तकनीक को बुनियादी ऊतक संस्कृति और माउस सुविधाओं के साथ प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है और ट्रांसलेशनल ऑन्कोलॉजी क्षेत्र में व्यापक अनुप्रयोग के लिए तैयार किया गया है।
Introduction
ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स पूर्व विवो त्रि-आयामी (3 डी) संगठित संस्कृतियां हैं जो ताजा ट्यूमर ऊतक से प्राप्त होती हैं और कैंसर मॉडल प्रदान करती हैं। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स मूल प्राथमिक ट्यूमर 1,2,3,4 की जैविक प्रमुख विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करते हैं और पारंपरिक अमर सेल लाइनों के समान कई महीनों तक विस्तारित और क्रायोसंरक्षित किया जा सकता है। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स ट्रांसलेशनल / व्यक्तिगत चिकित्सा5 के लिए रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर मॉडल का एक बायोबैंक प्रदान करते हैं और कैंसर सेल जीव विज्ञान प्रणालियों / मॉडल में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करते हैं। रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स का उपयोग (नव) सहायक ऑन्कोलॉजिकल / फार्माकोलॉजिकल उपचारों की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने के लिए पूर्व विवो मॉडल के रूप में किया जा सकता है, जिसके लिए संस्कृतियों को ताजा ट्यूमर ऊतक से स्थापित किया जाता है और दवा संवेदनशीलता परख या फार्माकोटाइपिंगको चिकित्सा की बाद की लाइनों के लिए प्रभावी एजेंटों की पहचान करने के लिए रोगी-विशिष्ट आधार पर किया जाता है।. इसके अलावा, ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स प्राथमिक ट्यूमर ऊतक की उपलब्धता की सीमा को दूर करते हैं और, अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि, विवो माउस मॉडल में एक उत्कृष्ट वैकल्पिक या पूरक प्रणाली प्रदान करते हैं, जैसे रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स)2। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की जटिलता बढ़ जाती है यदि प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं को स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ जोड़ा जाता है जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) में पाए जाते हैं, जैसे कि कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ), एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं, जो प्राथमिक ट्यूमर के कामकाज और जटिल सेलुलरिटी की नकल करती हैं। मानकीकृत प्रोटोकॉल 6,7,8,9,10 का उपयोग करके कई ट्यूमर प्रकारों के लिए ट्यूमर ऑर्गेनोइड स्थापित किए गए हैं। कोलोरेक्टल और स्तन कैंसर ऊतक सहित विभिन्न ठोस ट्यूमर से ऑर्गेनॉइड प्रसार, अच्छी तरह से स्थापित और तकनीकी रूप से सस्ती है 11,12,13,14,15।
सर्जिकल ट्यूमर रिसेक्शन या ट्यूमर बायोप्सी प्राथमिक ट्यूमर ऊतक नमूने प्रदान करते हैं। आदर्श रूप से, ट्यूमर ऊतक के नमूने ट्यूमर द्रव्यमान के केंद्र या ट्यूमर के हमलावर किनारे से आने चाहिए, साथ ही ट्यूमर से सटे सामान्य दिखने वाले ऊतक भी होने चाहिए। पारंपरिक 2 डी संस्कृतियों की तुलना में, ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स को कई “ऐड-ऑन” की आवश्यकता होती है, जिसमें एक जैविक तहखाने झिल्ली (जैसे मैट्रीगेल, हाइड्रोगेल, या कोलेजन-आधारित मचान) शामिल है, जो बाह्य टीएमई की नकल करता है, और एक तरल विकास माध्यम जो विशिष्ट पोषक तत्वों और विकास कारकों की आपूर्ति करता हैऔर संस्कृति में सेल प्रसार और व्यवहार्यता का समर्थन करता है।
प्राथमिक सेल कल्चर में सबसे बुनियादी कदम संदूषण को रोकने के लिए खारे घोल में ऊतक को धोना, यांत्रिक रूप से ट्यूमर को 1-3 मिमी3 के छोटे टुकड़ों में काटना / पचाना, और ऊतक के एंजाइमेटिक पाचन के लिए कोलेजनेस के साथ उपचार करना है। पचे हुए मिश्रण को तब बड़े ऊतक के टुकड़ों को हटाने के लिए फ़िल्टर किया जाता है, मैट्रिगेल जैसे जैविक तहखाने की झिल्ली में फिर से निलंबित किया जाता है, और गैर-लगाव विकास को बढ़ाने के लिए कम-लगाव संस्कृति प्लेटों में गुंबद के रूप में चढ़ाया जाता है। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों को तरल संस्कृति माध्यम के साथ कवर किया जाता है और संदूषण से बचने के लिए ग्लूटामाइन और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया जाता है, साथ ही ऊतक प्रकार 7,8,9,16,17 के आधार पर विशिष्ट विकास कारकों के साथ। थोक ट्यूमर और टीएमई के भीतर मौजूद अन्य प्रासंगिक कोशिकाओं को भी अलग किया जा सकता है, जैसे कि कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) और प्रतिरक्षा कोशिकाएं। यह तकनीक, जिसकी हाल हीमें समीक्षा की गई है, एक अधिक “यथार्थवादी” ट्यूमर वातावरण में चिकित्सा की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों के साथ सह-संस्कृतियों की स्थापना की अनुमति देता है। इसके अलावा, सेल-सेल इंटरैक्शन और ट्यूमर कोशिकाओं और आसपास के जैविक मैट्रिक्स के घटकों के बीच बातचीत का अध्ययन किया जा सकता है।
बायोप्सी या संरक्षित गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्यूमर ऊतक से ताजा ऊतक का उपयोग करके ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापना की सफलता दर लगभग 50% 11 है, और उत्तरार्द्ध से सफलता दर काफी हद तक ऊतक प्रकार और उत्पत्ति4, विशेष रूप से ट्यूमर ग्रेड और समग्र ट्यूमर सेलुलरिटी पर निर्भर है। त्रि-आयामी ट्यूमर मॉडल में अलग-अलग जटिलता होती है, सरल एककोशिकीय समुच्चय से लेकर विभिन्न सेल प्रकारों से युक्त अत्यधिक जटिल इंजीनियर मॉडल तक। साहित्य में 3 डी संस्कृतियों का वर्णन करने के लिए उपयोग की जाने वाली शब्दावली अत्यधिक असंगत 19,20,21 है, क्योंकि विभिन्न शब्दों जैसे स्फेरॉइड, ट्यूमरस्फीयर और ऑर्गेनोइड का उपयोग किया जाता है, हालांकि उनके बीच का अंतर स्पष्ट नहीं है। जैसा कि परिभाषा पर एक स्पष्ट सहमति अभी तक नहीं पहुंची है, इस लेख में, एक ट्यूमर ऑर्गनॉइड को एक जैविक तहखाने झिल्ली में एम्बेडेड एक संगठित ट्यूमर सेल संस्कृति के रूप में वर्णित किया गया है।
यहां, ताजा प्राथमिक या पीडीएक्स-व्युत्पन्न अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) से उत्पन्न ताजा ऊतक नमूनों से ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए एक मान्य प्रोटोकॉल की सूचना दी गई है, और यह प्रोटोकॉल बुनियादी ऊतक संवर्धन सुविधाओं के साथ अधिकांश प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को कई अत्याधुनिक रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है जो वर्तमान में डेविड ट्यूवसन9, हंस क्लेवर्स8 और ऑरेल पेरेन7 के समूहों से पाचन ट्यूमर ऊतक से ट्यूमर ऑर्गेनोइड ्स या ट्यूमरोइड्स स्थापित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।
यह प्रोटोकॉल इस बात पर चर्चा नहीं करता है कि ताजा ऊतक कैसे काटा जाता है। उच्च गुणवत्ता वाले ताजा मानव ट्यूमर ऊतक प्राप्त करने के लिए, ऊतक की कटाई करने वाले सर्जनों और पैथोलॉजी विभाग के बीच कुशल समन्वय होना महत्वपूर्ण है जो ऑर्गनॉइड कल्चर के लिए ऊतक का नमूना निकालता है। इसी तरह, एक ताजा ऊतक स्रोत के रूप में पीडीएक्स का उपयोग करते समय, ऊतक के नमूने की कटाई करने वाले व्यक्ति के साथ कुशल समन्वय भी महत्वपूर्ण है। उच्च गुणवत्ता बनाए रखने के लिए ऊतक का नमूना जितनी जल्दी हो सके (कटाई के समय से 30-60 मिनट के भीतर) प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
फार्माकोलॉजिकल कैंसर उपचारों में प्रमुख प्रगति चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि चरण 1 ऑन्कोलॉजी नैदानिक परीक्षणों में दवाओं के अनुमोदन की संभावना 5.1% है, जो सभी रोग प्रकारोंमें सबसे कम है। मुख्य कारण ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को प्लाटाफॉर्मा बायोबैंकोस वाई बायोमॉडेलोस – यूनिडाड्स डी लास प्लाटाफॉर्मस आईएससीIII डी एपोयो अला आई + डी + आई एन बायोमेडिसिना वाई सिएनसियास डी ला सालुद (पीटी 20/00045), यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से अनुदान समझौते संख्या 857381, परियोजना विजन (गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर के प्रारंभिक निदान के लिए वैज्ञानिक उत्कृष्टता और नवाचार क्षमता को मजबूत करने के लिए रणनीतियों) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। नैदानिक शोधकर्ताओं और उभरते अनुसंधान समूहों आईआरवाईसीआईएस (2021/0446), रोगी व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स 2.0 प्रोजेक्ट (सीआईबेरोएनसी) और ट्रांसकैन II परियोजना जेटीसी 2017 के लिए नई शोध परियोजनाओं के लिए इंट्राम्यूरल कॉल “अग्नाशयी न्यूरोएंडोक्राइन ट्यूमर (एनईएक्सटी) के रोगियों के प्रारंभिक निदान और अनुवर्ती के लिए एक एल्गोरिदम की स्थापना”, अनुदान संख्या 1.1.1.5 / ईआरएनईटी / इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए जैविक नमूने बायोबैंक अस्पताल रेमन वाई कैजल-आईआरवाईसीआईएस (बी.0000678) द्वारा प्रदान किए गए थे और आईएससीIII (पीटी 20/00045) के बायोबैंक और बायोमॉडल प्लेटफॉर्म में एकीकृत किए गए थे। हम इस प्रोटोकॉल को नेक्सटी और विजन परियोजनाओं के हिस्से के रूप में विकसित करने के लिए अपने अमूल्य समर्थन के लिए यवोन कोल, अगापी काटाकी वीटा रोविटा और थोर्स्टन नोल को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids – A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)
