Etablering av kreftavledede tumororganoider og fibroblaster fra friskt vev
Summary
Tumororganoider har revolusjonert kreftforskning og tilnærmingen til personlig medisin. De representerer en klinisk relevant tumormodell som gjør det mulig for forskere å ligge et skritt foran svulsten i klinikken. Denne protokollen etablerer tumororganoider fra ferske tumorvevsprøver fra bukspyttkjertelen og pasientavledede xenotransplantater av adenokarsinom opprinnelse i bukspyttkjertelen.
Abstract
Tumororganoider er tredimensjonale (3D) ex vivo tumormodeller som rekapitulerer de biologiske nøkkelfunksjonene i det opprinnelige primære tumorvevet. Pasientavledede tumororganoider har blitt brukt i translasjonell kreftforskning og kan brukes til å vurdere behandlingsfølsomhet og motstand, celle-celle-interaksjoner og tumorcelleinteraksjoner med tumormikromiljøet. Tumororganoider er komplekse kultursystemer som krever avanserte cellekulturteknikker og kulturmedier med spesifikke vekstfaktorcocktailer og en biologisk kjellermembran som etterligner det ekstracellulære miljøet. Evnen til å etablere primære tumorkulturer avhenger sterkt av opprinnelsesvevet, cellulariteten og de kliniske egenskapene til svulsten, som tumorgraden. Videre er vevsprøvetaking, materialkvalitet og kvantitet, samt korrekt biobanking og lagring viktige elementer i denne prosedyren. Laboratoriets tekniske evner er også avgjørende faktorer å vurdere. Her rapporterer vi en validert SOP/protokoll som er teknisk og økonomisk gjennomførbar for dyrkning av ex vivo tumororganoider fra ferske vevsprøver av pankreasadenokarsinom-opprinnelse, enten fra ferskt primært resektert pasientdonorvev eller pasientavledede xenotransplantater (PDX). Teknikken beskrevet her kan utføres i laboratorier med grunnleggende vevskultur og musefasiliteter og er skreddersydd for bred anvendelse innen translasjonell onkologi.
Introduction
Tumororganoider er ex vivo tredimensjonale (3D) organiserte kulturer som er avledet fra friskt tumorvev og gir kreftmodeller. Tumororganoider rekapitulerer de biologiske nøkkelfunksjonene til den opprinnelige primære svulsten 1,2,3,4 og kan utvides i opptil flere måneder og kryopreserveres, lik konvensjonelle immortaliserte cellelinjer. Tumororganoider gir en biobank av pasientavledede tumormodeller for translasjonell / personlig medisin5 og representerer et viktig fremskritt i kreftcellebiologiske systemer / modeller. Pasientavledede tumororganoider kan brukes som ex vivo-modeller for å forutsi effekten av (neo)adjuvante onkologiske/farmakologiske terapier, for hvilke kulturer etableres fra ferskt tumorvev og legemiddelsensitivitetsanalyser eller farmakotyping utføres på pasientspesifikt grunnlag for å identifisere effektive midler forpåfølgende behandlingslinjer1,4. Videre overvinner tumororganoider begrensningen av tilgjengeligheten av primærtumorvev og, enda viktigere, gir et utmerket alternativ eller komplementært system til in vivo musemodeller, slik som pasientavledede xenotransplantater (PDX)2. Kompleksiteten til tumororganoider økes dersom de primære tumorcellene kombineres med stromale celler som finnes i tumormikromiljøet (TME), slik som kreftassosierte fibroblaster (CAF), endotelceller og immunceller, som etterligner funksjonen og den komplekse cellulariteten til primærtumoren. Tumororganoider er etablert for mange tumortyper ved bruk av standardiserte protokoller 6,7,8,9,10. Organoid forplantning fra forskjellige solide svulster, inkludert kolorektal og brystkreftvev, er veletablert og teknisk rimelig 11,12,13,14,15.
Kirurgiske tumorreseksjoner eller tumorbiopsier gir primære tumorvevsprøver. Ideelt sett bør tumorvevsprøver komme fra midten av tumormassen eller den invaderende kanten av svulsten, så vel som normalt utseende vev ved siden av svulsten. Sammenlignet med konvensjonelle 2D-kulturer krever tumororganoider flere “tillegg”, inkludert en biologisk kjellermembran (som Matrigel, hydrogel eller et kollagenbasert stillas), som etterligner den ekstracellulære TME, og et flytende vekstmedium som leverer spesifikke næringsstoffer og vekstfaktorer og støtter celleproliferasjon og levedyktighet i kultur16.
De mest grunnleggende trinnene i primær cellekultur er å vaske vevet i saltoppløsning for å forhindre forurensning, mekanisk kutte / fordøye svulsten i små biter på 1-3 mm3, og behandling med kollagenase for enzymatisk fordøyelse av vevet. Den fordøyde blandingen blir deretter filtrert for å fjerne store vevfragmenter, resuspendert i en biologisk kjellermembran som Matrigel, og belagt som kupler i lavfestekulturplater for å forbedre ikke-vedleggsvekst. Kjellermembranmatrikskuplene er dekket med flytende kulturmedium og supplert med glutamin og antibiotika for å unngå forurensning, samt med spesifikke vekstfaktorer avhengig av vevstype 7,8,9,16,17. Andre relevante celler som er tilstede i bulktumoren og TME kan også isoleres, for eksempel kreftassosierte fibroblaster (CAF) og immunceller. Denne teknikken, som nylig har blitt gjennomgått18, tillater etablering av samkulturer med forskjellige celletyper for å studere responsen på terapi i et mer “realistisk” tumormiljø. Videre kan celle-celle-interaksjoner og samspillet mellom tumorceller og komponenter i den omkringliggende biologiske matrisen studeres.
Den rapporterte suksessraten for tumororganoid etablering ved bruk av ferskt vev fra biopsier eller resektert gastrointestinalt tumorvev er rundt 50%11, og suksessraten fra sistnevnte er i stor grad avhengig av vevstype og opprinnelse4, spesielt tumorgrad og total tumorcellularitet. Tredimensjonale tumormodeller har varierende kompleksitet, fra enkle encellede aggregater til svært komplekse konstruerte modeller bestående av ulike celletyper. Terminologien som brukes til å beskrive 3D-kulturer i litteraturen er svært inkonsekvent 19,20,21, da forskjellige begreper som sfæroider, tumorsfærer og organoider brukes, selv om forskjellen mellom dem er uklar. Siden en klar konsensus om definisjonen ennå ikke er nådd, er en tumororganoid i denne artikkelen beskrevet som en organisert tumorcellekultur innebygd i en biologisk kjellermembran.
Her rapporteres en validert protokoll for etablering av tumororganoider fra ferske vevsprøver utgått fra ferskt primært resektert eller PDX-avledet pankreasduktalt adenokarsinom (PDAC), og denne protokollen kan utføres i de fleste laboratorier med basale vevskulturfasiliteter. Denne protokollen er tilpasset fra flere toppmoderne rapporterte protokoller som for tiden brukes til å etablere tumororganoider eller tumoroider fra fordøyelsestumorvev fra gruppene David Tuveson9, Hans Clevers8 og Aurel Perren7.
Denne protokollen diskuterer ikke hvordan det ferske vevet høstes. For å oppnå ferskt humant tumorvev av høy kvalitet, er det viktig å ha effektiv koordinering mellom kirurgene som høster vevet og patologiavdelingen som trekker ut vevsprøven for organoidkultur. På samme måte, når du bruker PDX som en fersk vevskilde, er effektiv koordinering med personen som høster vevsprøven også viktig. Det er viktig å ta vevsprøven så raskt som mulig (innen 30-60 min fra høstetid) for å opprettholde høy kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Store fremskritt innen farmakologisk kreftbehandling er utfordrende, da sannsynligheten for godkjenning av legemidler i fase I onkologiske kliniske studier er 5,1%, som er den laveste av alle sykdomstyper23. Hovedårsaken er at kreft er svært heterogen, og derfor reagerer pasientkohorter ikke jevnt som forventet på den gitte behandlingen, noe som fremhever at en mer personlig tilnærming er nødvendig. Todimensjonale (2D) kulturer har blitt brukt i translasjonell kreftforskning i mange år, men …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av finansiering fra Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I + D + i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme under tilskuddsavtale nr. 857381, prosjekt VISION (Strategier for å styrke vitenskapelig fortreffelighet og innovasjonskapasitet for tidlig diagnose av gastrointestinale kreft), Intramural utlysning av nye forskningsprosjekter for kliniske forskere og nye forskningsgrupper IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) og TRANSCAN II-prosjektet JTC 2017 kaller “Etablering av en algoritme for tidlig diagnose og oppfølging av pasienter med pankreasnevroendokrine svulster (NExT)”, stipendnummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. De biologiske prøvene som ble brukt i denne protokollen ble levert av BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) og integrert i ISCIII Biobanks and Biomodels Platform (PT20/00045). Vi vil også takke Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita og Thorsten Knoll for deres uvurderlige støtte til å utvikle denne protokollen som en del av NExT- og VISION-prosjektene.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids – A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)
