JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Viabilitetsanalys av Trichoderma stromaticum Conidia inuti humana mononukleära makrofager i perifert blod

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65231
, , , ,
1Laboratory of Immunobiology – Department of Biological Sciences,State University of Santa Cruz – UESC, 2Università Degli Studi di Genova

Summary

Tekniken som involverar fagocytos av svampkonidier av makrofager används i stor utsträckning för studier som utvärderar moduleringen av immunsvaret mot svampar. Syftet med detta manuskript är att presentera en metod för att utvärdera fagocytos och clearanceförmåga hos humana mononukleära makrofager i perifert blod stimulerade med Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

Makrofager utgör en viktig försvarslinje och är ansvariga för att förhindra tillväxt och kolonisering av patogener i olika vävnader. Konidial fagocytos är en nyckelprocess som möjliggör undersökning av cytoplasmatiska och molekylära händelser som är involverade i makrofag-patogeninteraktioner, samt för bestämning av tidpunkten för döden av internaliserad konidi. Tekniken som involverar fagocytos av svampkonidier av makrofager används i stor utsträckning för studier som utvärderar moduleringen av immunsvaret mot svampar. Undvikande av fagocytos och flykt av fagosomer är mekanismer för svampvirulens. Här redovisar vi de metoder som kan användas för analys av fagocytos, clearance och livsduglighet hos T. stromaticum conidia, en svamp som används som biobekämpning och biogödselmedel och som kan inducera infektioner hos människor. Protokollet består av 1) Trichoderma-odling , 2) tvättning för att erhålla konidier, 3) isolering av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) med hjälp av polysackaroslösningsmetoden och differentiering av PBMC till makrofager, 4) en in vitro-fagocytosmetod med hjälp av runda glastäckglas och färgning, och 5) en clearance-analys för att bedöma konidiernas livskraft efter konidifagocytos. Sammanfattningsvis kan dessa tekniker användas för att mäta svampelimineringen av makrofager.

Introduction

Släktet Trichoderma (Ordning: Hypocreales, Familj: Hypocreaceae) består av allestädes närvarande, saprofytiska svampar som är parasiter på andra svamparter och som kan producera en rad kommersiellt användbara enzymer. Dessa svamparter används för produktion av heterologa proteiner2, produktion av cellulosa3, etanol, öl, vin och papper4, inom textilindustrin5, livsmedelsindustrin6 och inom jordbruket som biologiska bekämpningsmedel 7,8. Förutom det industriella intresset för dessa svamparter har det ökande antalet infektioner hos människor gett vissa Trichoderma-arter status som opportunistiska patogener9.

Trichoderma spp. växer snabbt i odling, med till en början vita och bomullsartade kolonier som blir gröngula till mörkgröna10. De är anpassade för att leva i ett brett spektrum av pH- och temperaturförhållanden, och de opportunistiska arterna kan överleva vid fysiologiska pH och temperaturer och därmed kolonisera olika mänskliga vävnader 11,12,13. Det är viktigt att notera att ökningen av infektionsfrekvensen hos Trichoderma spp. kan vara förknippad med virulensfaktorer, och dessa är inte väl studerade. Dessutom är studier som fokuserar på att förstå immunsvaret mot opportunistiska Trichoderma-arter fortfarande sällsynta.

Under en infektion, tillsammans med neutrofiler, representerar makrofager försvarslinjen som är ansvarig för fagocytos och förhindrar därmed tillväxt och kolonisering av patogener i olika vävnader. Med hjälp av mönsterigenkänningsreceptorer, såsom Toll-liknande receptorer och lektinreceptorer av C-typ, fagocytossvampar och bearbetar dem till fagolysosomer, vilket främjar en andningsbristning, frisättning av proinflammatoriska cytokiner och förstörelse av de fagocytoserade mikroorganismerna14. Mekanismen för fagocytos kan dock påverkas och undvikas av olika mikrobiella strategier, såsom svampcellernas storlek och form; närvaron av kapslar som hindrar fagocytos; minska antalet fagocytosinducerande receptorer; ombyggnad av strukturen av aktinfibrer i cytoplasman; hindrar bildandet av pseudopodier; och fagosomen eller fagolysosomen flyr efter fagocytosprocessen14.

Många patogener, inklusive Cryptococcus neoformans, använder makrofager som en nisch för att överleva i värden, sprida sig och inducera infektion15. Fagocytos- och clearanceanalysen används för att utvärdera immunsvaret mot patogener och för att identifiera de mikrobiella strategier som används för att undvika det medfödda immunsystemet 15,16,17. Denna typ av teknik kan också användas för att undersöka den differentiella kinetiken för fagocytos, fördröjd fagosomförsurning och oxidativ burst som resulterar i minskadsvampdöd.

Olika metoder kan användas för att utvärdera fagocytos, svampöverlevnad och undvikande av fagosommognadsprocessen. Dessa inkluderar fluorescensmikroskopi, som används för att observera fagocytos, cellulär lokalisering och de molekyler som produceras under fagocytos19; flödescytometri, som ger kvantitativa data om fagocytos och används för att utvärdera de olika markörer som är involverade i processen20,21; intravital mikroskopi, som används för att bedöma mikrobiell infångning och fagosommognad22; Antikroppsmedierad fagocytos, som används för att bedöma specificiteten hos fagocytosprocessen för en patogen23. och andra 24,25,26,27.

Protokollet som presenteras här använder en vanlig, billig och direkt metod som använder ett optiskt mikroskop och platttillväxtanalys för att bedöma fagocytos och avdödning av svampkonidier. Detta protokoll kommer att ge läsarna steg-för-steg-instruktioner för att utföra fagocytos- och clearanceanalysen med hjälp av humana mononukleära makrofager från perifert blod som exponerats för T. stromaticum. PBMC användes eftersom Trichoderma conidia används som en biologisk bekämpning mot fytopatogener och ett biogödselmedel för växtgrödor över hela världen och har orsakat flera infektioner hos människor, så kallad Trichodermosis. Utöver det finns det bara två tidigare arbeten som fokuserar på interaktionen mellan Trichoderma conidia och det mänskliga immunsystemet, där vi undersökte neutrofiler28 och autofagi i makrofager29. Denna artikel visar först hur fagocytosen av konidierna hos T. stromaticum av PBMC-härledda makrofager kan studeras, och sedan hur livskraften hos de uppslukade konidierna kan bedömas med hjälp av enkla mikroskopibaserade tekniker. Detta protokoll kan ytterligare underlätta undersökningar av makrofagassocierat immunsvar eller immunsystemmoduleringsrelaterade mekanismer.

Protocol

Etiska överväganden och människorAlla experiment med människor som beskrivs i denna studie utfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och brasilianska federala lagar och godkändes av State University of Santa Cruz etiska kommitté (projektidentifieringskod: 550.382/2014). Humant perifert blod samlades in från friska frivilliga från staden Ilhéus, Bahia, Brasilien, som inte exponerats för yrkesaktiviteter relaterade till den studerade svampen. Individer med …

Representative Results

Tekniken som involverar fagocytos av svampkonidier av makrofager används i stor utsträckning för studier som utvärderar moduleringen av immunsvaret mot svampar. Vi använde fagocytos av T. stromaticum conidia för att bedöma livskraften hos konidierna efter fagocytos, eftersom undvikande av fagocytos och flykt av fagosomer är mekanismer för svampvirulens. Forskare bör utföra dessa tekniker som en av de första analyserna när de undersöker en art av kliniskt intresse. <p class="jove_content biglege…

Discussion

För flera svamppatogener inklusive Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans och andra, är konidial eller jästfagocytos en nyckelprocess som möjliggör undersökning av cytoplasmatiska och molekylära händelser i makrofag-patogeninteraktioner, såväl som för bestämning av tidpunkten för döden av den internaliserade konidien 14,39,40. Fagocytos är nyckelprocessen i interaktion…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av följande brasilianska finansinstitut: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) med bidrag RED0011/2012 och RED008/2014. U.R.S., J.O.C. och M.E.S.M. erkänner stipendiet som beviljats av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) respektive FAPESB.

Materials

15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 7 – Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 16 – Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 17 – Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 26 – Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 24 – Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L., Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. , (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E., Maloy, S., Hughes, K. Multiplicity of infection. Brenner’s Encyclopedia of Genetics. Second Edition. , (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health – Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day – Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

Keywords: TrichodermaMacrophagesPhagocytosisImmune SystemViability AssayConidial ClearanceBiocontrol AgentPathogenicityPeripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)
check_url/65231?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image