गोजातीय यकृत कोशिकाओं में लिपिड बूंद आकार और संलयन का मूल्यांकन
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल बताता है कि लिपिड बूंदों (एलडी) को रंगने के लिए तेल लाल ओ का उपयोग कैसे करें, फैटी एसिड-प्रेरित फैटी हेपेटोसाइट मॉडल में एलडी के आकार और संख्या की गणना करें, और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा बड़े एलडी में फ्यूज होने वाले छोटे एलडी की प्रक्रिया का निरीक्षण करने के लिए बीओडीआईपीवाई 493/503 का उपयोग करें।
Abstract
लिपिड ड्रॉपलेट्स (एलडी) ऑर्गेनेल हैं जो कोशिकाओं में लिपिड चयापचय और तटस्थ लिपिड भंडारण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे विभिन्न प्रकार के चयापचय रोगों से जुड़े होते हैं, जैसे मोटापा, फैटी यकृत रोग और मधुमेह। यकृत कोशिकाओं में, एलडी के आकार और संख्या फैटी यकृत रोग के संकेत हैं। इसके अलावा, ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया, सेल ऑटोफैगी और एपोप्टोसिस अक्सर एलडी के आकार और संख्या में परिवर्तन के साथ होते हैं। नतीजतन, एलडी के आयाम और मात्रा एलडी बायोजेनेसिस के तंत्र के बारे में वर्तमान शोध का आधार हैं। यहां, फैटी एसिड-प्रेरित गोजातीय यकृत कोशिकाओं में, हम वर्णन करते हैं कि एलडी को दागने के लिए तेल लाल ओ का उपयोग कैसे करें और एलडी के आकार और संख्या की जांच करें। एलडी के आकार वितरण का सांख्यिकीय विश्लेषण किया जाता है। छोटे एलडी के बड़े एलडी में फ्यूज होने की प्रक्रिया को लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम द्वारा भी देखा जाता है। वर्तमान कार्य विभिन्न शारीरिक स्थितियों के तहत एलडी के आकार परिवर्तन की प्रवृत्ति का सीधे निरीक्षण करने का एक तरीका प्रदान करता है।
Introduction
हेपेटोसाइट्स में लिपिड ड्रॉपलेट (एलडी) संचय गैर-मादक फैटी यकृत रोग (एनएएफएलडी) की विशिष्ट विशेषता है, जो यकृत फाइब्रोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा में प्रगति कर सकता है। यह पाया गया है कि फैटी यकृत रोग की सबसे पहली अभिव्यक्ति स्टीटोसिस है, जो हेपेटोसाइट1 के साइटोप्लाज्म में एलडी संचय की विशेषता है। लिवर स्टीटोसिस हमेशा एलडीएस2 की बढ़ी हुई संख्या और / या विस्तारित आकार से जुड़ा होता है। एलडी को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) से उत्पन्न माना जाता है, जिसमें कोर के रूप में ट्राइग्लिसराइड (टीजी) होता है, और प्रोटीन और फॉस्फोलिपिड्स3 से घिरा होता है। टीजी भंडारण के लिए जिम्मेदार उपकोशिकीय अंग के रूप में, एलडी अपने आकार, संख्या, लिपिड संरचना, प्रोटीन और अन्य ऑर्गेनेल के साथ बातचीत के बारे में विभिन्न विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं, जिनमें से सभी सेल ऊर्जा होमियोस्टैसिस4 को प्रभावित करते हैं। टीजी स्तर एलडी के आकार के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है, और एक उच्च इंट्रासेल्युलर टीजी सामग्री बड़े एलडी5 का निर्माण कर सकती है। टीजी के स्थानीय संश्लेषण, ईआर में लिपिड निगमन और कई एलडी6 के संलयन के माध्यम से एलडी आकार में वृद्धि करते हैं। कोशिकाओं (एडिपोसाइट्स, हेपेटोसाइट्स, आदि) जिनमें बड़े एलडी होते हैं, उनमें एलडी संलयन द्वारा लिपिड भंडारण को कुशलतापूर्वक बढ़ाने के लिए एक विशेष तंत्र होता है। एलडी के गतिशील परिवर्तन सेल के विभिन्न ऊर्जा चयापचय राज्यों को दर्शाते हैं। ऐसी पद्धतियों को विकसित करना महत्वपूर्ण है जो स्वस्थ और असामान्य कोशिकाओं में विभिन्न यकृत एलडी के अवलोकन और विश्लेषण की अनुमति देते हैं।
एलडी के लिए मुख्य गैर-फ्लोरोसेंट रंजक सूडान ब्लैक बी और तेल लाल ओ सूडान ब्लैक बी दाग तटस्थ लिपिड, फॉस्फोलिपिड्स और स्टेरॉयड7 हैं। तेल लाल ओ मुख्य रूप से कंकाल की मांसपेशी, कार्डियोमायोसाइट्स, यकृत ऊतक, वसा कोशिकाओं आदि के एलडी को धुंधला करने के लिए उपयोग किया जाताहै, और चूहोंऔर मनुष्यों में यकृत स्टीटोसिस की मात्रात्मक पहचान के लिए एक मानक उपकरण माना जाता है। एलडी का गतिशील परिवर्तन मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति रंगाई द्वारा किया जाता है। नील लाल और बीओडीआईपीवाई दोनों आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले फ्लोरोसेंट लिपिड रंजक10,11 हैं। नील लाल की तुलना में, बीओडीआईपीवाई में मजबूत ऊतक पारगम्यता होती है और एलडी12 के साथ बेहतर बांधती है। बीओडीआईपीवाई-लेबल वाले एलडी का उपयोग जीवित कोशिकाओं को धुंधला करने और अन्य ऑर्गेनेल13 के साथ सह-स्थानीयकरण के लिए किया जा सकता है।
मोनोगैस्ट्रिक जानवरों की तुलना में जुगाली करनेवाले जानवरों में फैटी यकृत रोग की घटना काफी अधिक है। संक्रमण अवधि के दौरान, डेयरी गायों को नकारात्मक ऊर्जा संतुलन की स्थिति का अनुभव होताहै। बड़ी मात्रा में गैर-एस्टरिफाइड फैटी एसिड (पामिटिक एसिड, ओलिक एसिड, लिनोलिक एसिड, आदि) गोजातीय हेपेटोसाइट्स में टीजी में संश्लेषित होते हैं, जिससे यकृत कार्यात्मक असामान्यता होती है और दूध उत्पादों की गुणवत्ता औरउत्पादन दक्षता बहुत कम हो जाती है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एलडी के आकार और संख्या का विश्लेषण करने के साथ-साथ एलडी संलयन गतिशीलता की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। हमने हेपेटोसाइट्स16 में लिनोलिक एसिड (एलए) की विभिन्न सांद्रता को जोड़कर एलडी गठन का एक मॉडल बनाया और तेल लाल ओ के साथ एलडी को धुंधला करके प्रक्रिया के दौरान एलडी के आकार और संख्या में परिवर्तन देखा। इसके अलावा, एलडी के तेजी से संलयन की प्रक्रिया को बीओडीआईपीवाई 493/503 के साथ धुंधला करके भी देखा गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
पैथोलॉजिकल राज्यों के आधार पर, हेपेटिक एलडी उनके आकार और संख्या में जबरदस्त बदलाव से गुजरते हैं। एलडी व्यापक रूप से हेपेटोसाइट कोशिकाओं में मौजूद हैं और यकृत स्वास्थ्य और रोग18 में महत्वपूर्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को संयुक्त रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (U1904116) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
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