本协议描述了如何使用油红O染色脂滴(LDs),计算脂肪酸诱导的脂肪肝细胞模型中LDs的大小和数量,并使用BODIPY 493 / 503观察小LDs通过活细胞成像融合成大LD的过程。
脂滴(LD)是在细胞中的脂质代谢和中性脂质储存中起重要作用的细胞器。它们与多种代谢疾病有关,如肥胖、脂肪肝和糖尿病。在肝细胞中,LD的大小和数量是脂肪肝疾病的征兆。此外,氧化应激反应、细胞自噬和细胞凋亡通常伴随着LDs的大小和数量的变化。因此,LDs的尺寸和数量是目前LD生物发生机制研究的基础。在这里,在脂肪酸诱导的牛肝细胞中,我们描述了如何使用油红O来染色LD并研究LD的大小和数量。对LDs的大小分布进行统计分析。活细胞成像系统也观察到小LD融合成大LD的过程。本工作为直接观察不同生理条件下LDs的大小变化趋势提供了一种途径。
脂滴(LD)在肝细胞中的积累是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的典型特征,可进展为肝纤维化和肝细胞癌。已经发现脂肪肝疾病的最早表现是脂肪变性,其特征是LD在肝细胞1的细胞质中蓄积。肝脂肪变性总是与LDs的数量增加和/或扩大有关2。LD被认为是由内质网(ER)产生的,由甘油三酯(TG)作为核心组成,并被蛋白质和磷脂包围3。作为负责TG储存的亚细胞器,LDs在大小,数量,脂质组成,蛋白质以及与其他细胞器的相互作用方面表现出不同的特征,所有这些都会影响细胞能量稳态4。TG水平与LDs的大小呈正相关,较高的细胞内TG含量可以形成更大的LDs5。LD通过TG的局部合成,ER中的脂质掺入以及多个LD的融合而增加尺寸6。含有大LD的细胞(脂肪细胞,肝细胞等)具有通过LD融合有效增加脂质储存的特殊机制。LDs的动态变化反映了细胞不同的能量代谢状态。开发能够观察和分析健康和异常细胞中各种肝LD的方法至关重要。
LDs的主要非荧光染料是苏丹黑B和油红O.苏丹黑B染色中性脂质,磷脂和类固醇7。油红O主要用于骨骼肌、心肌细胞、肝组织、脂肪细胞等LD染色8.,被认为是定量检测小鼠和人类肝脂肪变性的标准工具9。LDs的动态变化主要通过荧光染色进行。尼罗红和BODIPY都是常用的荧光脂质染料10,11。与尼罗河红相比,BODIPY具有更强的组织通透性,与LDs12结合更好。BODIPY标记的LD可用于活细胞染色和与其他细胞器共定位13。
反刍动物脂肪肝的发病率明显高于单胃动物14。在过渡期间,奶牛会经历负能量平衡状态3.牛肝细胞中大量非酯化脂肪酸(棕榈酸、油酸、亚油酸等)合成TGs,导致肝功能异常,大大降低奶制品品质和生产效率15。本研究旨在提供一种协议来分析LD的大小和数量,以及监测LD融合动力学。通过在肝细胞16 中添加不同浓度的亚油酸(LA)构建LD形成模型,并通过用油红O染色LD观察LD在此过程中大小和数量的变化。此外,通过用BODIPY 493/503染色也观察到LDs快速融合的过程。
根据病理状态,肝LD的大小和数量会发生巨大变化。LD广泛存在于肝细胞中,在肝脏健康和疾病中起关键作用18。LDs的数量和大小是目前LDs19生物发生研究的基础。细胞和组织LD的大小和数量反映了它们储存和释放能量的能力。LDs的动态变化维持脂质代谢活动的稳定性20,21。LDs的异常积累发生在各种病理条件下,可能是?…
The authors have nothing to disclose.
本研究由国家自然科学基金(U1904116)共同支持。
0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
cell counting chamber | equipment | ||
cell culture dish | Corning | 353002 | material |
cell sens software | Olympus IX73 | software | |
Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
Image view | image analysis sodtware | ||
linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
NIS-Elements | Nikon | software | |
oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
Pipette | Eppendorf | equipment | |
Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |