Denne protokol skitserer trinnene til justering af in vivo optisk kohærenstomografi i synligt lys (vis-OCTF) billeder med ex vivo konfokale billeder af samme musenethinde med det formål at verificere den observerede retinale ganglioncelleaxonbundtmorfologi i in vivo-billederne.
I de senere år er in vivo retinal billeddannelse, som giver ikke-invasiv, realtid og langsgående information om biologiske systemer og processer, i stigende grad blevet anvendt til at opnå en objektiv vurdering af neurale skader i øjensygdomme. Ex vivo konfokal billeddannelse af den samme nethinden er ofte nødvendig for at validere in vivo fund, især i dyreforsøg. I denne undersøgelse demonstrerede vi en metode til at justere et ex vivo konfokal billede af musens nethinde med dets in vivo-billeder . En ny klinisk klar billeddannelsesteknologi kaldet synligt lys optisk kohærenstomografi fibergrafi (vis-OCTF) blev anvendt til at erhverve in vivo-billeder af musens nethinden. Vi udførte derefter den konfokale billeddannelse af den samme nethinde som “guldstandarden” for at validere in vivo vis-OCTF-billederne. Denne undersøgelse muliggør ikke kun yderligere undersøgelse af de molekylære og cellulære mekanismer, men etablerer også et fundament for en følsom og objektiv evaluering af neurale skader in vivo.
Retinale ganglionceller (RGC’er) spiller en kritisk rolle i visuel informationsbehandling, modtager synaptiske input gennem deres dendritiske træer i det indre plexiformlag (IPL) og transmitterer informationen via deres axoner i retinale nervefiberlag (RNFL) til hjernen 1,2,3,4. Ved syge tilstande som glaukom kan tidlig RGC-degeneration resultere i subtile ændringer i RNFL, ganglioncellelaget (GCL), IPL og synsnerven hos både patienter og gnavermodeller 5,6,7,8,9. Tidlig påvisning af disse morfologiske ændringer i RGC’er er derfor afgørende for rettidig indgriben for at forhindre RGC og synstab.
Vi har for nylig udviklet en ny klinisk klar billeddannelsesteknologi kaldet synligt lys optisk kohærenstomografi (vis-OCT) for at tilfredsstille behovet for in vivo-overvågning af RGC-skader. Vis-OCT forbedrede den aksiale opløsning og nåede 1,3 μm i nethinden10,11, hvilket muliggør visualisering af individuelle RGC-axonbundter i RNFL. Derefter blev vis-OCT-fibergrafi (vis-OCTF) etableret for at spore og kvantificere RGC-skader på enkeltaxonbundtniveau hos mus11,12,13. Imidlertid er ex vivo konfokal billeddannelse af den samme nethinden som guldstandarden ofte nødvendig for at validere in vivo-resultaterne. Derfor vil denne undersøgelse demonstrere, hvordan man tilpasser in vivo-billeder erhvervet af vis-OCTF med ex vivo-konfokale billeder af den samme musenethinde. Protokollen har til formål at validere in vivo-resultaterne ved ex vivo konfokal billeddannelse og etablere et grundlag for at undersøge de molekylære og cellulære ændringer, der ligger til grund for RGC-skader under syge tilstande.
Der er to trin i denne protokol, der kræver opmærksomhed. For det første er det nødvendigt at sikre, at dyret er under dyb anæstesi, og at deres øjne er fuldt udvidede inden vis-OCT-billeddannelse. Hvis musene ikke bedøves tilstrækkeligt, kan deres hurtige vejrtrækning føre til ustabile bevægelser af ansigtsbillederne , hvilket kan påvirke fibergrammets kvalitet negativt. Desuden kan utilstrækkelig udvidelse også have en negativ indvirkning på billedkvaliteten, da iris kan blokere lyset og forhind…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse er støttet af Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 og Knights Templar Eye Foundation.
Equipment | |||
Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
Drugs and antibodies | |||
4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |