Summary

Alignement de fibrogrammes de tomographie par cohérence optique en lumière visible avec des images confocales de la même rétine de souris

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

Le présent protocole décrit les étapes de l’alignement des images in vivo de la tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) avec des images confocales ex vivo de la même rétine de souris dans le but de vérifier la morphologie observée des faisceaux axonaux des cellules ganglionnaires de la rétine dans les images in vivo.

Abstract

Ces dernières années, l’imagerie rétinienne in vivo , qui fournit des informations non invasives, en temps réel et longitudinales sur les systèmes et les processus biologiques, a été de plus en plus utilisée pour obtenir une évaluation objective des lésions neuronales dans les maladies oculaires. L’imagerie confocale ex vivo de la même rétine est souvent nécessaire pour valider les résultats in vivo , en particulier dans la recherche animale. Dans cette étude, nous avons démontré une méthode d’alignement d’une image confocale ex vivo de la rétine de souris avec ses images in vivo . Une nouvelle technologie d’imagerie prête à l’emploi appelée fibre de tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) a été appliquée pour acquérir des images in vivo de la rétine de souris. Nous avons ensuite réalisé l’imagerie confocale de la même rétine que le « gold standard » pour valider les images in vivo vis-OCTF. Cette étude permet non seulement d’approfondir l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires, mais aussi d’établir les bases d’une évaluation sensible et objective des lésions neuronales in vivo.

Introduction

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) jouent un rôle essentiel dans le traitement de l’information visuelle, recevant des entrées synaptiques par l’intermédiaire de leurs arbres dendritiques dans la couche plexiforme interne (IPL) et transmettant l’information via leurs axones dans la couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL) au cerveau 1,2,3,4. Dans les affections pathologiques telles que le glaucome, la dégénérescence précoce du CGR peut entraîner des changements subtils dans le RNFL, la couche de cellules ganglionnaires (GCL), l’IPL et le nerf optique chez les patients et les modèles de rongeurs 5,6,7,8,9. La détection précoce de ces changements morphologiques dans les CGR est donc essentielle pour une intervention rapide afin de prévenir les CGR et la perte de vision.

Nous avons récemment mis au point une nouvelle technologie d’imagerie prête à l’emploi, appelée tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCT), afin de répondre au besoin de surveillance in vivo des lésions du CGR. Vis-OCT a amélioré la résolution axiale, atteignant 1,3 μm dans la rétine10,11, ce qui a permis de visualiser les faisceaux axonales RGC individuels dans le RNFL. Par la suite, la fibre vis-OCT (vis-OCTF) a été établie pour suivre et quantifier les dommages au CGR au niveau du faisceau axonale unique chez les souris11,12,13. Cependant, l’imagerie confocale ex vivo de la même rétine que l’étalon-or est souvent nécessaire pour valider les résultats in vivo. Par conséquent, cette étude démontrera comment aligner les images in vivo acquises par vis-OCTF avec les images confococaux ex vivo de la même rétine de souris. Le protocole vise à valider les résultats in vivo par imagerie confocale ex vivo et à établir une base pour examiner les changements moléculaires et cellulaires sous-jacents aux dommages causés par le CGR dans des conditions pathologiques.

Protocol

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie et sont conformes aux directives sur l’utilisation des animaux de l’Institut national de la santé (NIH). Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole. 1. Imagerie in vivo vis-OCT <l…

Representative Results

Le fibrogramme vis-OCT composite est comparé à l’image confocale correspondante d’une rétine montée à plat immunocolorée avec Tuj-1 pour les axones RGC (Figure 1D, panneau supérieur). Les faisceaux d’axones imagés par vis-OCTF peuvent être appariés avec les faisceaux d’axones marqués Tu-j1 sur l’image confocale. Les vaisseaux sanguins présentent généralement des structures ramifiées distinctes par rapport aux faisceaux axonaux environnants dans les images de fibrogra…

Discussion

Il y a deux étapes dans ce protocole qui nécessitent une attention particulière. Tout d’abord, il est nécessaire de s’assurer que l’animal est sous anesthésie profonde et que ses yeux sont complètement dilatés avant l’imagerie vis-OCT. Si les souris ne sont pas correctement anesthésiées, leur respiration rapide peut entraîner des mouvements instables des images du visage , ce qui peut nuire à la qualité du fibrogramme. De plus, une dilatation insuffisante peut également avoir un impact néga…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude est financée par la subvention Shaffer de la Fondation pour la recherche sur le glaucome, le prix de collaboration 4-CA Cavalier, R01EY029121, R01EY035088 et la Fondation Knights Templar Eye.

Materials

Equipment
Halo 100 Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA) Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 1-2 drops
Bovine serum albumin powder Fisher Scientific, BP9706-100 1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) Covetrus, NDC 11695-4860-1 15.6 mg/mL
Ketamine Covetrus, NADA043304 114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1 A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia 1:200
Normal donkey serum(NDS) Millipore Sigma, S30-100 mL 1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 1:10
Rat anti-ICAM-2 BD Pharmingen, Cat#553325 1:500
Tropicamide drops  Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)
VWR, CAS: 9002-93-1 1:20
Vectashield mounting medium Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine Covetrus, NDC59399-110-20 17 mg/kg

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Cite This Article
Chang, S., Xu, W., Fan, W., McDaniel, J. A., Grannonico, M., Miller, D. A., Liu, M., Zhang, H. F., Liu, X. Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina. J. Vis. Exp. (196), e65237, doi:10.3791/65237 (2023).

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