Das vorliegende Protokoll beschreibt die Schritte zum Abgleich von in vivo Bildern der optischen Kohärenztomographie (Vis-OCTF) mit konfokalen ex vivo Bildern derselben Mausnetzhaut, um die beobachtete Morphologie der retinalen Ganglienzell-Axonbündel in den in vivo Bildern zu verifizieren.
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Methodenartikel
Abgleich von optischen Kohärenztomographie-Fasergrammen im sichtbaren Licht mit konfokalen Bildern derselben Maus-Netzhaut
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In den letzten Jahren wurde die In-vivo-Netzhautbildgebung, die nicht-invasive, Echtzeit- und Längsschnittinformationen über biologische Systeme und Prozesse liefert, zunehmend eingesetzt, um eine objektive Beurteilung von neuronalen Schäden bei Augenerkrankungen zu erhalten. Die konfokale Ex-vivo-Bildgebung derselben Netzhaut ist oft notwendig, um die in vivo Befunde zu validieren, insbesondere in Tierversuchen . In dieser Studie haben wir eine Methode demonstriert, mit der ein konfokales ex vivo Bild der Maus-Netzhaut mit ihren in vivo Bildern abgeglichen werden kann. Eine neue klinische Bildgebungstechnologie, die optische Kohärenztomographie (vis-OCTF), wurde eingesetzt, um In-vivo-Bilder der Netzhaut der Maus zu erhalten. Anschließend führten wir die konfokale Bildgebung derselben Netzhaut wie den "Goldstandard" durch, um die in vivo vis-OCTF-Bilder zu validieren. Diese Studie ermöglicht nicht nur die weitere Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, sondern schafft auch die Grundlage für eine sensitive und objektive Bewertung von neuronalen Schäden in vivo.
Einleitung
Retinale Ganglienzellen (RGCs) spielen eine entscheidende Rolle bei der visuellen Informationsverarbeitung, indem sie synaptische Inputs über ihre dendritischen Bäume in der inneren plexiformen Schicht (IPL) empfangen und die Informationen über ihre Axone in der retinalen Nervenfaserschicht (RNFL) an das Gehirn weiterleiten 1,2,3,4. Bei Erkrankungen wie dem Glaukom kann eine frühe RGC-Degeneration sowohl bei Patienten als auch bei Nagetiermodellen zu subtilen Veränderungen der RNFL, der Ganglienzellschicht (GCL), des IP....
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Protokoll
Alle Tierbehandlungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia genehmigt und entsprachen der Richtlinie zur Verwendung von Tieren des National Institute of Health (NIH). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. In-vivo-Vis-OCT-Bildgebung
- Das vis-OCT-System
- Bilden Sie die Augen der Mäuse mit einem Vis-OCT-System für kleine Tiere ab, das eine Superkontinuumslichtquelle verwendet, die eine Beleuchtung mit sichtbarem Licht zwischen 480 nm und 6....
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Ergebnisse
Das zusammengesetzte Vis-OCT-Fasergramm wird mit dem entsprechenden konfokalen Bild einer flach montierten Netzhaut verglichen, die mit Tuj-1 für RGC-Axone immungefärbt wurde (Abbildung 1D, oben). Axonbündel, die mit vis-OCTF abgebildet werden, können mit den Tu-j1-markierten Axonbündeln auf dem konfokalen Bild abgeglichen werden. Blutgefäße weisen in der Regel unterscheidbare Verzweigungsstrukturen im Vergleich zu umgebenden Axonbündeln in Fibergrammbildern auf, die mit den ICAM-2-markierte.......
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Diskussion
Es gibt zwei Schritte in diesem Protokoll, die Aufmerksamkeit erfordern. Zunächst muss sichergestellt werden, dass sich das Tier unter Tiefennarkose befindet und dass seine Augen vor der Vis-OCT-Bildgebung vollständig geweitet sind. Wenn die Mäuse nicht ausreichend betäubt werden, kann ihre schnelle Atmung zu instabilen Bewegungen der Gesichtsbilder führen, was sich negativ auf die Qualität des Fibergramms auswirken kann. Darüber hinaus kann sich eine unzureichende Dilatation auch negativ auf die Bildqualität au.......
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Offenlegungen
Chang, S., Keine; Xu, W., Keine; Fan, W., keiner; McDaniel, J.A., Keine; D.A. Miller, Nichts; M. Grannonico, Nichts; M. Liu, Nichts; X. Liu, Nichts; H.F. Zhang hat finanzielle Interessen an Opticent Health, die diese Arbeit nicht unterstützt haben.
Danksagungen
Diese Studie wird unterstützt durch den Shaffer Grant der Glaucoma Research Foundation, den 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 und die Knights Templar Eye Foundation.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 Mikroskop | Carl Zeiss | ||
| Medikamente und Antikörper | |||
| 4% Paraformaldehyd (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 Tropfen | |
| Rinderserumalbuminpulver | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Esel-Anti-Maus-Alexa-Fluor-488-Farbstoff | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1.000 | |
| Esel-Anti-Ratte Alexa Fluor 594-Farbstoff | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1.000 | |
| Euthasol (eine Mischung aus Pentobarbital-Natrium (390 mg/ml) und Phenytoin-Natrium (50 mg/ml)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15,6 mg/mL | |
| Ketamin Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | ||
| Maus Anti-Tuj1 | Ein Geschenk von Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normales Eselserum (NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 10x), pH 7,4 (Enthält 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4 und 20 mM KH2PO4) | Thermo Fisher Scientific, Kat# J62036. K3 | 1:10 | |
| Ratte anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Kat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamid fällt | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagenzqualität) | VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield Eindeckmedium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazin | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
Referenzen
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal gangli....
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Nachdrucke und Genehmigungen
