Summary

Justering av optisk koherenstomografi i synligt ljus med konfokala bilder av samma musnäthinna

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

I detta protokoll beskrivs stegen för att anpassa in vivo-bilder med optisk koherenstomografifibergrafi (vis-OCTF) i synligt ljus med ex vivo konfokala bilder av samma musnäthinna i syfte att verifiera den observerade morfologin för näthinnans gangliecellsaxonbunt i in vivo-bilderna.

Abstract

Under de senaste åren har in vivo retinal avbildning, som ger icke-invasiv, realtids- och longitudinell information om biologiska system och processer, i allt högre grad tillämpats för att få en objektiv bedömning av nervskador vid ögonsjukdomar. Ex vivo konfokal avbildning av samma näthinna är ofta nödvändig för att validera in vivo-fynden, särskilt i djurförsök. I denna studie demonstrerade vi en metod för att anpassa en ex vivo konfokalbild av musens näthinna med dess in vivo-bilder. En ny klinisk avbildningsteknik som kallas synligt ljus optisk koherenstomografi fibergrafi (vis-OCTF) användes för att ta in vivo-bilder av musens näthinna. Vi utförde sedan den konfokala avbildningen av samma näthinna som “guldstandarden” för att validera in vivo vis-OCTF-bilderna. Denna studie möjliggör inte bara ytterligare undersökning av de molekylära och cellulära mekanismerna utan etablerar också en grund för en känslig och objektiv utvärdering av nervskador in vivo.

Introduction

Retinala ganglieceller (RGC) spelar en avgörande roll i visuell informationsbearbetning, tar emot synaptiska intryck genom sina dendritiska träd i det inre plexiforma skiktet (IPL) och överför informationen via sina axoner i retinala nervfiberskiktet (RNFL) till hjärnan 1,2,3,4. Vid sjukdomstillstånd som glaukom kan tidig RGC-degeneration resultera i subtila förändringar i RNFL, gangliecelskiktet (GCL), IPL och synnerven hos både patienter och gnagarmodeller 5,6,7,8,9. Tidig upptäckt av dessa morfologiska förändringar i RGC är därför avgörande för att kunna ingripa i tid för att förhindra RGC och synförlust.

Vi har nyligen utvecklat en ny klinisk avbildningsteknik som kallas optisk koherenstomografi i synligt ljus (vis-OCT) för att tillgodose behovet av in vivo-övervakning av RGC-skador. Vis-OCT förbättrade den axiella upplösningen och nådde 1,3 μm i näthinnan10,11, vilket möjliggjorde visualisering av enskilda RGC-axonknippen i RNFL. Därefter etablerades vis-OCT-fibergrafi (vis-OCTF) för att spåra och kvantifiera RGC-skador på nivån för ett axonknippe i möss11,12,13. Ex vivo konfokalavbildning av samma näthinna som guldstandarden är dock ofta nödvändig för att validera in vivo-fynden. Därför kommer denna studie att visa hur man kan anpassa in vivo-bilder tagna av vis-OCTF med ex vivo konfokala bilder av samma musnäthinna. Protokollet syftar till att validera in vivo-fynden genom ex vivo konfokal avbildning och etablera en grund för att undersöka de molekylära och cellulära förändringar som ligger till grund för RGC-skador vid sjukdomstillstånd.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Virginia och överensstämde med riktlinjerna för användning av djur från National Institute of Health (NIH). Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll. 1. In vivo i förhållande till OCT-avbildning Vis-ULT-systemetFöreställ dig mössens ögon med hjälp av …

Representative Results

Det sammansatta vis-OCT-fibergrammet jämförs med motsvarande konfokalbild av platt monterad näthinna immunfärgad med Tuj-1 för RGC-axoner (figur 1D, övre panelen). Axonbuntar avbildade av vis-OCTF kan matchas med de Tu-j1-märkta axonbuntarna på konfokalbilden. Blodkärl uppvisar vanligtvis urskiljbara förgreningsstrukturer jämfört med omgivande axonbuntar i fibergrambilder, vilket kan matchas med de ICAM-2-märkta blodkärlen på konfokalbilden (Figur 1D</stro…

Discussion

Det finns två steg i det här protokollet som kräver uppmärksamhet. För det första är det nödvändigt att se till att djuret är under djup bedövning och att ögonen är helt vidgade före ULT-avbildning. Om mössen inte är tillräckligt bedövade kan deras snabba andning leda till instabila rörelser i ansiktsbilderna , vilket kan påverka fibergrammets kvalitet negativt. Dessutom kan otillräcklig utvidgning också ha en negativ inverkan på bildkvaliteten eftersom iris kan hindra ljuset och hindra de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöds av Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 och Knights Templar Eye Foundation.

Materials

Equipment
Halo 100 Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA) Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 1-2 drops
Bovine serum albumin powder Fisher Scientific, BP9706-100 1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) Covetrus, NDC 11695-4860-1 15.6 mg/mL
Ketamine Covetrus, NADA043304 114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1 A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia 1:200
Normal donkey serum(NDS) Millipore Sigma, S30-100 mL 1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 1:10
Rat anti-ICAM-2 BD Pharmingen, Cat#553325 1:500
Tropicamide drops  Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)
VWR, CAS: 9002-93-1 1:20
Vectashield mounting medium Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine Covetrus, NDC59399-110-20 17 mg/kg

References

  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).
check_url/65237?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Chang, S., Xu, W., Fan, W., McDaniel, J. A., Grannonico, M., Miller, D. A., Liu, M., Zhang, H. F., Liu, X. Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina. J. Vis. Exp. (196), e65237, doi:10.3791/65237 (2023).

View Video