实验室检测可利用基于光学相干断层扫描（OCT）的年龄相关性黄斑变性（AMD）多模态纵向成像的预后价值。在组织切片前，对患有和不患有AMD的人类供体眼球分别进行OCT、彩色成像、近红外反射扫描激光检眼镜以及两种激发波长下的自发荧光成像。
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方法文章
离体 基于OCT的多模态成像技术用于年龄相关性黄斑变性的人类供体眼研究
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
从基于光学相干断层扫描（OCT）的多模态（MMI）临床影像中学习到的年龄相关性黄斑变性（AMD）进展序列，可为实验室研究结果提供额外的预后价值。在本研究中， 离体 OCT 和 MMI 在人眼供体视网膜组织切片前应用于眼球。眼球取自年龄 ≥80 岁的非糖尿病白人供体，死亡至保存时间（DtoP）≤6 小时。眼球在原地获取后，使用 18 mm 环钻进行划痕以方便角膜移除，并浸入缓冲的 4% 多聚甲醛中。在移除前节结构后，使用解剖显微镜和单反相机，通过透射、反射及闪光照明在三种放大倍数下获取彩色眼底图像。眼球被置于定制设计的腔室内的缓冲液中，腔室配备 60 屈光度透镜。随后使用谱域 OCT（30° 黄斑立方体扫描，30 µm 间距，平均次数 = 25）、近红外反射、488 nm 自发荧光和 787 nm 自发荧光进行成像。年龄相关性黄斑变性（AMD）眼球显示视网膜色素上皮（RPE）改变，伴有玻璃膜疣或视网膜下玻璃膜疣样沉积物（SDDs），伴或不伴有新生血管，且无其他病因证据。2016 年 6 月至 2017 年 9 月期间，共获取 94 只右眼和 90 只左眼（DtoP：3.9 ± 1.0 小时）。在 184 只眼球中，40.2% 存在 AMD，包括早期或中期（22.8%）、萎缩型（7.6%）和新生血管型（9.8%）AMD，39.7% 黄斑区无明显异常。通过 OCT 鉴定出玻璃膜疣、SDDs、高反射灶、萎缩区域和纤维血管瘢痕。观察到的伪影包括组织混浊、脱离（杆锥层、视网膜、RPE、脉络膜）、中心凹囊样改变、RPE 波浪状形态以及机械性损伤。为指导冷冻切片，OCT 体积数据用于定位中心凹和视盘解剖标志以及特定病理改变。 离体 体积通过以下方式进行了配准 体内 通过选择眼动追踪的参考函数来确定体积。 离体 病理表现的可见度 体内 取决于保存质量。在16个月内，通过临床MMI方法获取并分期了75例处于AMD各阶段的快速DtoP供体眼。
引言
在光学相干断层扫描（OCT）指导下，采用抗VEGF疗法管理新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）已有十五年，这为这一常见致盲病因的进展顺序和微观结构提供了新的认识。其中一项重要认识是，AMD是一种涉及神经感觉视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜的三维疾病。通过对临床试验患者以及接受治疗患者的对侧眼进行OCT成像，现已认识到超出彩色眼底摄影（数十年来的临床标准）所见的多种病理特征。这些特征包括视网膜内新生血管（3型黄斑新生血管1，曾称为血管样增生）、视网膜下玻璃膜疣样沉积物（SDDs，亦称网状假性玻璃膜疣）2、RPE命运的多种演变途径3,4，以及在萎缩区域中显著胶质化的Müller细胞5,6。
缺乏黄斑（细胞和动物）的模型系统可重现这种复杂疾病的某些方面7,8,9。进一步减轻年龄相关性黄斑变性（AMD）负担的成功可能源于在人眼中发现并探索其原发性病理，理解黄斑独特....
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方案
伯明翰阿拉巴马大学的机构审查委员会批准了本实验室研究，该研究遵循优良实验室规范以及生物安全二级/二级以上标准。所有美国眼库均符合2006年《统一解剖赠与法案》和美国食品药品监督管理局的规定。大多数美国眼库（包括Advancing Sight Network）均符合美国眼库协会的医学标准。
材料表 列出了所需的耗材和设备。补充材料1 概述了组织解剖、彩色眼底摄影以及基于光学相干断层扫描（OCT）的微血管成像（MMI）。补充材料2 提供了基于OCT的MMI的详细信息。
1. 组织采集的标准
- 为了在未记录信息的供体筛选中最大化获得年龄相关性黄斑变性（AMD）眼睛的产量，应设定以下可接受供体的标准：年龄 ≥80 岁、白人、非糖尿病患者，且死亡至保存时间（DtoP）≤6 小时。
注：DtoP 定义为死亡时间与眼球被放入所提供的保存液之间的时间间隔，保存操作可在医院或实验室进行。
2. 保存液及其他准备工作（实验室）
- 从20%储备液（购买）配制4%磷酸盐缓冲多聚甲醛。取200 mL 20%多聚甲醛（稀释倍数为5）加入800 mL 0.....
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结果
表1 显示在2016至2017年间，来自94名非糖尿病白人供体的184只眼睛 >80岁。平均死亡至保存时间间隔为3.9小时（范围：2.0–6.4小时）。在回顾的184只眼球中，75只（40.2%）确诊为年龄相关性黄斑变性（AMD）。所识别的分类如下：无明显异常（39.7%）、可疑（11.4%）、早期-中期AMD（22.8%）、萎缩型（7.6%）、新生血管型（9.8%）、其他（8.7%）以及未知/未记录/不可分级（<1%). 图2, 图3, 图4，以及 图5 显示多尺度、多模态 离体 对本系列中保存极为完好的眼球进行成像。这些眼球的评估由一位专注于视网膜疾病的眼科医生（J.A.K.）协作完成。尽管某些眼球在个别特征上显示更清晰，但这些病例因整体质量高而被选中。
如上所述
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讨论
在新冠疫情前的16个月期间，采用基于人群的筛查方法，成功获取了75例患有年龄相关性黄斑变性（AMD）的供体眼球。所有样本均在较短的死亡至摘取时间（DtoP）内获取，并通过光学相干断层扫描（OCT）锚定的宏观-微观-影像学（MMI）分期方法进行分期。年龄标准（>80岁）超出了用于可移植角膜的组织回收通常所考虑的年龄范围。尽管供体年龄较大，但根据我们的标准，仍获得了涵盖年龄相关性黄斑变性（AMD）各个阶段的眼组织。许多视网膜色素上皮（RPE）表型在所有AMD阶段中均常见，而部分表型则特异存在于新生血管性AMD中3,46直接比较 离体 和 体内 成像（图7）证实了短的D到P时间是一个关键因素，此外还需要专家的操作处理（图1），在生成 离体 足以进行高级别诊断分类的外视网膜图像，其中部分样本适用于成像与组织学之间的直接对照分析
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披露
C.A.C. 获得海德堡工程公司的研究资助，并担任艾佩利西斯、安斯泰来、勃林格殷格翰、Character Bioscience 和 Osanni 的顾问。T.A. 获得诺华公司的研究资助，并担任罗氏、诺华、拜耳、尼德克和艾佩利西斯的顾问。K.B.F. 担任基因泰克、蔡司、海德堡工程、艾尔建、拜耳和诺华的顾问。
致谢
我们感谢 Heidelberg Engineering 提供仪器以及原始眼 holder 的设计，感谢 Richard F. Spaide 医学博士引入基于光学相干断层扫描的多模态成像技术，感谢 Christopher Girkin 医学博士协助使用临床成像设备，以及感谢 David Fisher 提供图 1。人类供体眼球的获取研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 R01EY06019（C.A.C.）、P30 EY003039（Pittler）、R01EY015520（Smith）、R01EY027948（C.A.C., T.A.）、R01EY030192（Li）、R01EY031209（Stambolian）和 U54EY032442（Spraggins）、IZKF Würzburg（N-304, T.A.）、阿拉巴马州 EyeSight 基金会、国际视网膜研究基金会（C.A.C.）、Arnold 和 Mabel Beckman 黄斑变性研究倡议（C.A.C.）以及防盲研究基金会 AMD Catalyst（Schey）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 烧杯，250 mL | Fisher | # 02-540K | |
| 瓶子，1 L，Pyrex | Fisher | # 10-462-719 | 用于保存剂的储存 |
| 本生灯或热源 | Eisco | # 17-12-818 | 用于熔化石蜡 |
| 数码相机 | Nikon D7200 | D7200 | |
| 计算机及存储设备 | Apple | iMac Pro；14 TB 外置硬盘 | 图像存储 |
| 保温容器 | Fisher | # 02-591-45 | 用于湿冰 |
| 容器，每位供体2个，40 mL | Fisher | Sameco Bio-Tite 40 mL # 13-711-86 | 用于保存剂 |
| 石英坩埚，30 mL | Fisher | # 08-072D | 用于眼球摄影时固定眼球 |
| 量筒，250 mL | Fisher | # 08-549G | |
| 消毒清洁用品 | https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html | ||
| 带透镜和安装支架的眼球固定装置 | 联系 J. Messinger | jeffreymessinger@uabmc.edu | 基于海德堡工程公司原始设计的定制改装 |
| 面部防护口罩 | Fisher | # 19-910-667 | |
| Harmon Fix 镊子 | Roboz | # RS-8247 | |
| 显微有齿镊 | Roboz | # RS-5232 | |
| 组织镊 | Roboz | # RS-5172 | |
| 玻璃培养皿，Kimax | Fisher | # 23064 | |
| 钻石纹手套 | Fisher | # MF-300 | |
| GenPro 防护服 | Fisher | # 19-166-116 | |
| 图像编辑软件 | Adobe | Photoshop 2021，Creative Suite | |
| KimWipes 纸巾 | Fisher | # 06-666 | |
| 灯，三头蛇形管 | Schott Imaging | # A20800 | |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ 1000 | 用于解剖 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX9 | 用于眼底彩色摄影 |
| 多聚甲醛，20% | EMS | # 15713-S | 用于保存剂；稀释后储存 |
| pH 计 | Fisher | # 01-913-806 | |
| 磷酸盐缓冲液，Sorenson's，0.2 M，pH 7.2’ | EMS | # 11600-10 | |
| 环形闪光灯 | B & H Photo Video | Sigma EM-140 DG | |
| 红宝石珠，直径1 mm | Meller Optics | # MRB10MD | |
| 3M 防护眼镜 | Fisher | # 19-070-940 | |
| 扫描激光检眼镜 | Heidelberg Engineering | HRA2 | |
| 弹簧弯剪 | Roboz | # RS-5681 | |
| 锐器盒 | Fisher | # 1482763 | |
| 快门线，遥控 | Nikon | MC-DC2 | |
| 谱域 OCT 设备 | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA&OCT | https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf |
| 不锈钢钢珠，直径25.4 mm | McMaster-Carr | # 9529K31 | |
| 组织标记染料，黑色 | Cancer Diagnostics Inc | # 0727-1 | |
| 组织切片刀片 | Thomas Scientific | # 6767C18 | |
| 环钻，直径18 mm | Stratis Healthcare | # 6718L | |
| 电视监视器（HDMI）及数码相机连接线 | B&H Photo Video | BH # COHD18G6PROB | 用于实时观察和远程相机显示功能 |
| 粉红色牙科石蜡 | EMS | # 72670 | |
| 木制涂药棒 | Puritan | # 807-12 |
参考文献
- Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
- Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A.
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重印与许可
