Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל הצטברות ליפופוסצין בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושי (RPE) מובחנות ומקוטבות מאוד ובדיקת פגוציטוזה משופרת של סגמנט חיצוני (OS) כדי לזהות את יכולת הצריכה/השפלה הכוללת של מערכת ההפעלה של RPE. שיטות אלה מתגברות על המגבלות של מודלים קודמים של ליפופוסצין ומבחני פאגוציטוזה קלאסיים של הקטע החיצוני של מרדף הדופק.

Abstract

הפאגוציטוזה היומית של המקטעים החיצוניים של קולטני האור על ידי אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) תורמת להצטברות פיגמנט הזדקנות תוך תאי המכונה ליפופוסצין. הרעילות של ליפופוסצין מבוססת היטב במחלת סטארגארדט, ניוון הרשתית התורשתי הנפוץ ביותר, אך שנויה יותר במחלוקת בניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך בעולם המפותח. קביעת רעילות ליפופוסצין בבני אדם הייתה קשה, ולמודלים של בעלי חיים של סטארגארדט יש רעילות מוגבלת. לכן, מודלים במבחנה המחקים RPE in vivo אנושי נדרשים כדי להבין טוב יותר את יצירת ליפופוסצין, פינוי ורעילות. רוב המודלים של ליפופוסצין בתרבית תאים עד כה היו בקווי תאים או כללו הזנת RPE ברכיב יחיד של תערובת ליפופוסצין המורכבת ולא במקטעים/קצוות של כל המקטע החיצוני של קולטני האור, מה שיוצר מודל ליפופוסצין שלם ופיזיולוגי יותר. מתוארת כאן שיטה לגרימת הצטברות של חומר דמוי ליפופוסצין (המכונה חומר אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול, או UAM) ב- RPE ראשוני טרום לידתי אנושי מובחן מאוד (hfRPE) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הנגזר RPE. UAM הצטבר בתרביות על ידי הזנה חוזרת ונשנית של מקטעי מערכת הפעלה שטופלו באור אולטרה סגול שנקלטו על ידי RPE באמצעות פגוציטוזה. הדרכים העיקריות שבהן UAM מקורב ושונה מ lipofuscin in vivo נדונים גם. בליווי מודל זה של הצטברות דמוית ליפופוסצין, מוצגות שיטות הדמיה להבחנה בין ספקטרום אוטופלואורסצנטי רחב של גרגרי UAM לבין צביעת נוגדנים בו-זמנית. לבסוף, כדי להעריך את ההשפעה של UAM על יכולת הפאגוציטוזה של RPE, הוצגה שיטה חדשה לכימות ספיגה ופירוק של מקטע חיצוני. שיטה זו, המכונה "Total Consumptive Capacity", מתגברת על פרשנויות שגויות אפשריות של יכולת פגוציטוזה RPE הטבועה במבחני "מרדף דופק" קלאסיים של המקטע החיצוני. המודלים והטכניקות שהוצגו כאן יכולים לשמש לחקר מסלולי ייצור ופינוי ליפופוסצין ורעילות משוערת.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מספק תמיכה קריטית עבור photoreceptors over, כולל ספיגה יומית והשפלה של קצוות או מקטעים של מקטע חיצוני photoreceptor (לאורך פרוטוקול זה, מערכת ההפעלה קיצור מייצג טיפים או מקטעים של מערכת ההפעלה ולא מקטעים חיצוניים שלמים). ספיגה יומית זו של RPE פוסט-מיטוטי בסופו של דבר מעמיסה על קיבולת פגוליזומלית ומובילה להצטברות של חומר תוך-תאי אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול, המכונה ליפופוסצין. באופן מעניין, מספר מחקרים הוכיחו גם כי RPE lipofuscin יכול להצטבר ללא מערכת ההפעלה phagocytosis 1,2. Lipofuscin יש רכיבים רבים, כולל adducts cross-linked נגזר רטינואידים מחזור הראייה, והוא יכול לתפוס כמעט 20% מנפח התא RPE עבור אלה מעל גיל 803.

השאלה אם ליפופוסצין רעיל נדונה בלהט. מחלת סטארגרדט היא ניוון אוטוזומלי רצסיבי של הפוטורצפטורים וה-RPE שבו מוטציה ב-ABCA4 גורמת לעיבוד לא תקין של רטינואידים במחזור הראייה הכלולים במקטעים החיצוניים של קולטני האור. עיבוד רטינואיד לא תקין מוביל לקישור צולב חריג ולהיווצרות של מיני ביס-רטינואידים, כולל ביס-רטינואיד N-רטינילidene-N-רטינילאתנולאמין (A2E). מחקרים הדגימו מנגנונים מרובים לרעילות A2E 4,5. ליפופוסצין תורם לאותות אוטופלואורסצנטיים של פונדוס במהלך הדמיה קלינית, וגם המטופלים של סטארגרדט וגם מודלים של בעלי חיים מראים עלייה בפונדוס אוטופלואורסצנטיות לפני ניוון הרשתית, מה שמרמז על מתאם בין רמות ליפופוסצין ורעילות 6,7. עם זאת, עם הגיל, lipofuscin מצטבר בכל בני האדם מבלי לעורר ניוון RPE. יתר על כן, בניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), שבו ניוון RPE מתרחש רק בחולים קשישים, אלה עם צורות מוקדמות ובינוניות של המחלה יש פחות אותות אוטופלואורסצנטיים פונדוס מאשר בני אדם שאינם חולים תואמי גיל8. ממצאים קליניים אלה אומתו גם ברמה ההיסטולוגית 9,10.

מודלים של בעלי חיים של הצטברות ליפופוסצין RPE השאירו גם עמימות מסוימת לגבי רעילות ליפופוסצין. עכבר הנוקאאוט ABCA4 אינו מציג ניוון רשתית על רקע פיגמנט, בעוד שהוא עושה זאת על רקע לבקנים או כאשר הוא נחשף לאור כחול11,12. יתר על כן, הרעילות של ליפופוסצין שמקורה בנוקאאוט ABCA4 ככל הנראה שונה מהליפופוסצין המצטבר לאט יותר המתרחש עם ההזדקנות הטבעית, כפי שניתן לראות ב- AMD13.

מודלים במבחנה של הצטברות ליפופוסצין מספקים חלופה לחקר ההשפעות של הצטברות ליפופוסצין על בריאות RPE. מודלים כאלה מאפשרים מניפולציה של רכיבי ליפופוסצין, החל מהזנת רכיבי רטינואיד בודדים ועד להאכלת מערכת ההפעלה, ומאפשרים מחקר ב-RPE של בני אדם ולא של בעלי חיים. בשני העשורים האחרונים פותחו שיטות רבות למדל ליפופוסצין RPE בתרבית. יחד עם קבוצות אחרות, הקבוצה של ד"ר בולטון האכילה את מערכת ההפעלה של בקר מדי יום במשך עד שלושה חודשים במעבר 4 עד 7 תאי RPE ראשוניים אנושיים מתורמים בגילאי 4 עד 85 בגילאי14. לחלופין, עיכוב של אוטופגיה הוביל גם להצטברות ליפופוסצין במעברים 3 עד 7 תרביות RPE אנושיות ראשוניות15. עם זאת, עיכוב ליזוזומלי תת-קטלני בתרביות RPE ראשוניות (hfRPE) אנושיות מובחנות מאוד, מעבר 1, לא הצליח לגרום לליפופוצין, אפילו עם תוספת חוזרת ונשנית של מערכת ההפעלה על בסיס יומי16.

כגישה רדוקציוניסטית יותר, אחרים הזינו רכיבי ליפופוסצין בודדים לתרביות, במיוחד ביס-רטינואיד A2E 4,17. מחקרים כאלה הם בעלי ערך בכך שהם מגדירים מנגנונים ישירים פוטנציאליים של רעילות עבור רכיבי ליפופוסצין בודדים, ומסבכים, למשל, כולסטרול ליזוזומלי והומאוסטזיס סרמיד18. יחד עם זאת, יש ויכוח על הרעילות של A2E19, והאכלתו ישירות לתאים עוקפת את המסלול האופייני להצטברות ליפופוסצין, הכוללת פגוציטוזה של מערכת ההפעלה photoreceptor. בניסיון להעביר את כל מרכיבי הליפופוסצין לתרביות RPE, בולטון ומרשל טיהרו ליפופוסצין מעיניים אנושיות והזינו אותו למעבר 4 עד 7 תרביות RPE ראשוניות אנושיות שמקורן בתורמים אנושיים עובריים וקשישים20. למרות היותה חדשנית, שיטה זו מייצגת מקור ליפופוסצין מוגבל לניסויים חוזרים.

בעוד הזנות חוזרות ונשנות של מערכת ההפעלה לתרביות RPE מייצרות ליפופוסצין במערכות רבות, היא אינה מצליחה לעשות זאת בתרביות RPE ראשוניות מובחנות מאוד16. מערכת הפעלה לחמצון תמונות גורמת לתגובות קישור צולבות כמו היווצרות ביס-רטינואיד המתרחשת באופן טבעי במהלך היווצרות ליפופוסצין in vivo. זה יכול להאיץ היווצרות גרגירים דמויי ליפופוצין במערכות תרבית RPE, אפילו אלה שהן מאוד מובחנות ועמידות בפני הצטברות ליפופוסצין16. כאן מוצגת שיטה להשראת הצטברות גרגירים דמויי ליפופוסצין ב-hfRPE מובחן מאוד וב-iPSC-RPE אנושי, ששונתה מפרוטוקול21 שפורסם על ידי Wihlmark. לשיטה זו יש את היתרון של גרגירים דמויי ליפופוצין המשתמשים באותו מקור (photoreceptor OS) ומסלול (ספיגת מערכת הפעלה פגוליזומלית) כפי שקורה עבור lipofuscinogenesis in vivo. יתר על כן, זה נעשה על תרבויות RPE אנושיות כי הם מאוד מובחנים ומתוקפים במחקרים מרובים כדי לשכפל RPE אנושי in vivo22,23,24. גרגירים דמויי ליפופוסצין אלה מכונים חומר אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול (UAM), והם מספקים נתונים ודיונים בפרוטוקול זה המשווה בין UAM ל- in vivo lipofuscin. יחד עם שיטות לבנייה והערכה של תרבויות עמוסות UAM ב- RPE אנושי מובחן מאוד, מוצגת גם שיטה מעודכנת להערכת פגוציטוזה של מערכת ההפעלה RPE. הוצגו מספר שיטות מצוינות לכימות פגוציטוזה של מערכת ההפעלה, כולל כתם מערבי, אימונוציטוכימיה ו-FACS25,26,27. עם זאת, בשלב מוקדם של מרדף הדופק של מערכת ההפעלה, תנאים שמובילים לקליטה לקויה של מערכת ההפעלה יכולים להיות מבולבלים עם תנאים המקדמים השפלה מהירה של מערכת ההפעלה המופנמת. השיטה המוצגת כאן מודדת את הכמות הכוללת של מערכת ההפעלה שהוצגה שנצרכת/מתפרקת במלואה על ידי RPE ("Total Consumptive Capacity"), ובכך מסייעת בביטול עמימות זו. צפוי כי תובנות לגבי רעילות ליפופוסצין המשתמשות בפרוטוקולים אלה, כולל השפעות על שיעורי הפאגוציטוזה של מערכת ההפעלה תוך שימוש בשיטת "Total Consumptive Capacity", ישמשו כדי לשפוך אור על הרעילות של lipofuscin in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי הכולל רכישה ושימוש ברקמה אנושית נבדק ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת מישיגן (HUM00105486).

1. הכנת קצוות ושברי מקטע חיצוני מחומצן

הערה: רשתיות בקר כהות נרכשו ונשלחו על קרח (ראה טבלת חומרים). מרשתיות אלה, מערכת ההפעלה טוהרה בעקבות פרוטוקול23 שפורסם בעבר.

  1. חיבור צולב של קטע חיצוני עם מנורת UV
    1. יש לטבול שקופיות מצופות פוליטטרה-פלואורואתילן לחלוטין (ראו טבלת חומרים) באתנול 70% למשך 10 דקות בארון בטיחות ביולוגית כדי לעקר את המגלשות. הניחו למגלשות להתייבש באוויר בכלי תרבית תאים סטרילי בקוטר 100 מ"מ.
    2. הניחו כל שקופית בצלחת תרבית תאים חדשה אחת בקוטר 100 מ"מ והוסיפו 200 מיקרוליטר של תרבית תאים המכילה בסרום (כל מדיה המשמשת בדרך כלל לתרביות RPE בהישג יד) לכל מלבן, ולאחר מכן הניחו אור UV ידני בגודל 254 ננומטר (ראו טבלת חומרים) על צלחת תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ (ללא מכסה) כשהנורה פונה ישירות לשקופית, ולחשוף במשך 20 דקות. המדיה המשמשת במיוחד למחקר זה ומספרי המוצרים הספציפיים עבור רכיבי המדיה פורסמו בעבר22,23. מדיה זו מכונה "מדיה RPE" לאורך פרוטוקול זה.
      הערה: טיפול UV של המדיה חוסם את משטח הזכוכית ומונע ממערכת ההפעלה להידבק במהלך השלבים הבאים.
    3. הפשיר aliquots קפוא של מערכת ההפעלה ב 37 ° C (ביד או באמצעות אמבט מים). כמות מערכת ההפעלה הדרושה תלויה ביישום. באופן כללי, ניתן לטפל עד 500 μL של 2 x 108 OS/mL לכל מלבן על השקופית.
    4. לאחר ההפשרה, סובב את מערכת ההפעלה ב 2400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו מיד את הסופרנאטנט בארון הבטיחות הביולוגית באמצעות פיפטה ולא ואקום כדי למנוע אובדן מקרי של הכדור.
    5. השהה מחדש בעדינות את הגלולה עם PBS סטרילי.
      הערה: עקוב אחר עוצמת הקול שהושהתה מחדש והריכוז הצפוי. לדוגמה, השעיה מחדש של הגלולה מצינור 1 מ"ל של 1 x 10 8 OS/mL עם PBS 500 μL מניבה 2 x 108 OS/mL. הנפח והריכוז המרביים למלבן בשקופית המצופה פוליטטרה-פלואורואתילן הם 500 μL של 2 x 108 OS/mL.
    6. שאפו את המדיה מהשקופיות והניחו עד 500 μL של 2 x 108 OS/mL PBS פתרון על כל מלבן של השקופית. הניחו את אור ה-UV הנישא ביד על צלחת תרבית התאים (ללא מכסה) כשהנורה פונה ישירות למערכת ההפעלה. חשפו את פתרון מערכת ההפעלה לאור של 254 ננומטר למשך 40 דקות.
      הערה: במהלך 40 דקות החשיפה, כסו את מנורת ה-UV ואת הכלי במגבת או בכרית סופגת, סגרו את אבנט ארון הבטיחות הביולוגית וכבו את המפוח. זה ימנע אידוי משמעותי מלהתרחש. אם מנורת UV המשמשת בפרוטוקול זה אינה זמינה לחוקר, ישנן שתי חלופות כדי להבטיח את הכמות המתאימה של cross-linking מושגת. הראשון הוא לעקוב אחר החשיפה הכמותית לקרינת UV המתוארת בשלב 1.2, בין אם עם המכשיר המתואר בשלב 1.2 או מכשיר אחר שיכול לספק את אותה חשיפה כמותית לקרינה כמו המכשיר האמור בשלב 1.2. חלופה אחרת היא לחשוף את מערכת ההפעלה לקרינת על-סגול למשך זמן שגורם למידת הקישור הצולב, על כתם קומאסי שניתן לראות באיור 1C.
    7. אספו את תמיסת PBS של מערכת ההפעלה המטופלת בצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליות, שטפו מחדש את המלבן של המגלשה המצופה עם 200-500 מיקרוליטר של PBS (2-3x), ואספו כל שטיפה בצינור המיקרוצנטריפוגה. לאחר שתסיים, התבונן בשקופית מתחת למיקרוסקופ חדר תרבית רקמות כדי לאשר שכמעט כל מערכת ההפעלה הוסרה מהשקופית.
    8. סובב את פתרון PBS של מערכת ההפעלה במהירות של 2400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, שאף את PBS בארון הבטיחות הביולוגית עם פיפטור והשהה מחדש במדיה סטנדרטית של 500 μL שתשמש לתרביות RPE (למשל - "מדיית RPE" המוגדרת בסעיף 1.1.2). ניתן לכוונן את נפח המתלים בהתבסס על ריכוז מערכת ההפעלה המחומצנת באור (OxOS) הרצוי.
    9. מניחים 10 μL של המתלה בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, מדללים 50-100x עם יותר מדיה של תרבית תאים, וסופרים את מערכת ההפעלה עם המוציטומטר.
    10. בהתבסס על ספירת מערכות ההפעלה, דלל את מתלה OxOS לריכוז מלאי סופי. להאכלת תרביות RPE בוגרות מאוד בטרנסוולים בעלי 24 בארות (שטח פנים של 0.33 ס"מ 2; ראה טבלת חומרים), מומלץ ריכוז מדיה סופי של2 x 107 OS/mL.
      1. כדי להשיג זאת, הפץ את OxOS לתוך 25 μL aliquots בריכוז 5.6 x 107 OS/mL, מושעה במדיה סטנדרטית RPE תרבית. לאחר הפשרת aliquot של 25 μL, ערבבו את האליקוט כולו עם 45 μL של מדיה סטנדרטית של תרבית RPE, וסיפקו נפח מדיה סופי של 70 μL וריכוז מערכת הפעלה של 2 x 107 OS/mL עבור כל הזנת Transwell של OxOS.
    11. לפני שתצטטו את OxOS, הוסיפו ליגנדות גישור פאגוציטוזה (Protein S ו-MFG-E8, ראו טבלת חומרים), המקלות על ספיגת מערכת ההפעלה וצבירת ליפופוסצין. ריכוזי העבודה של ליגנדות גישור בטרנסוול בן 24 בארות הם 4 מיקרוגרם/מ"ל עבור חלבון S מטוהר אנושי ו-1.5 מיקרוגרם/מ"ל עבור MFG-E8 רקומביננטי אנושי. לפיכך, עבור 25 μL aliquots של OxOS ב 5.6 x 107 OS/mL, ריכוז המלאי עבור חלבון S הוא 11.2 מיקרוגרם / מ"ל, ועבור MFG-E8 הוא 4.2 מיקרוגרם / מ"ל.
      הערה: ריכוזי ליגנד הגישור הותאמו לתרביות hfRPE על טרנסוולים של 24 בארות, עם ספירת תאים משוערת של 320,000 תאים לכל בארשל 0.33 ס"מ 2. ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוזי הליגנד לסוגי RPE אחרים ולצפיפויות תאים, מכיוון שליגנדות הנמצאות מעבר לזמינות קולטני הפאגוציטוזה עלולות לחסום באופן פרדוקסלי את ספיגת מערכת ההפעלה28.
    12. הצמד להקפיא את aliquots בחנקן נוזלי.
      הערה: הפשרות הקפאה מרובות מזיקות מאוד לשלמות מערכת ההפעלה.
  2. קישור צולב של מקטע חיצוני עם מכשיר קרוסלינקר UV
    הערה: בצע את שלב 1.1, למעט השלבים הבאים, שמחליפים את שלבים 1.1.2 ו- 1.1.6, בהתאמה:
    1. (מחליף את שלב 1.1.2) הניחו כל שקופית בצלחת תרבית תאים חדשה בקוטר 100 מ"מ והוסיפו 200 מיקרוליטר של תרבית תאים המכילה סרום (למשל -"מדיית RPE" או כל תחליף אחר) לכל מלבן, ולאחר מכן הניחו את השקופיות במכשיר קרוסלינקר אולטרה סגול (ראו טבלת חומרים), תוך טיפול ב-UV של 254 ננומטר בחשיפה קורנת של 3-6 J/cm2 כדי לחסום את משטח הזכוכית ולמנוע הידבקות של מערכת ההפעלה במהלך השלבים הבאים.
    2. (מחליף את שלב 1.1.6) שאפו את המדיה מהשקופיות והניחו עד 500 μL של 2 x 108 OS/mL בPBS סטרילי על כל מלבן של השקופית. הניחו שקופיות במכשיר הקרוסלינקר האולטרה סגול, הגדירו את החשיפה לקורן הטיפול לפי הצורך (3-9 J/cm2), וטפלו ב-254 ננומטר.
      הערה: ניתן לקבוע בזהירות את החשיפה הדרושה לקרינה על-ידי טיטרציה של חשיפה לקרינה בין 3-9 J/cm2 עד למידת האוטופלואורסצנטיות, וקישור צולב חלבונים (כפי שניתן לראות באיור 1B ובאיור 1C).
      התראה: טיפול במערכת ההפעלה מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית עלול לגרום לזיהום. לאחר חשיפת מערכת ההפעלה להתקן UV Crosslinker, יש לאסוף את מערכת ההפעלה עם קצוות פיפטה סטריליים, להעביר לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליות, ולטפל בכל השלבים הנוספים במכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית.
  3. אפיון מערכת הפעלה מחומצנת
    1. כימות ספקטרום הפליטה האוטופלואורסצנטית על ידי הדמיה
      1. מקם 20-50 μL של תמיסת מלאי ממערכת ההפעלה הלא מטופלת ו- OxOS לשני צינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים. צנטריפוגה ב 2400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, להשהות מחדש את הגלולה באגירה (למשל PBS) 4% paraformaldehyde, ולתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. לאחר הקיבוע, יש לסחוט כלפי מטה כנ"ל, לשטוף עם PBS x 2 (מסתובב בין השטיפות), ולאחר מכן להשהות מחדש בפחות מ-30 מיקרוליטר של PBS.
      3. הניחו כמה מיקרוליטרים של המתלה על שקופית מיקרוסקופ, הוסיפו אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים), ולבסוף כיסוי.
      4. תמונה OxOS במיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים).
        הערה: ניתן לעורר אוטופלואורסצנטיות של OxOS על ידי טווח רחב של אורכי גל לייזר, אך בדרך כלל משתמשים בקו לייזר של 405 ננומטר או 488 ננומטר. הפליטה רחבה באופן דומה, אך מערך טיפוסי של מסנן עירור/פליטה GFP/FITC מספיק כדי להציג אוטופלואורסצנטיות.
      5. כדי למדוד את ספקטרום הפליטה של OxOS, השתמש בסריקת λ במיקרוסקופ קונפוקלי. הגדרות סריקת λ טיפוסיות כוללות עירור עם 405 ננומטר או 488 ננומטר, וזיהוי פליטה שנעה בין 10 ננומטר מוסט לאדום מקו העירור בלייזר עד כ 800 ננומטר, עם גודל צעד λ של 10 ננומטר. לכל מערכת מיקרוסקופיה יש הוראות משלה כיצד להשתמש במצב λ, והקורא צריך להתייחס למדריך עבור הקונפוקל הספציפי שלהם.
    2. כחלופה, לכמת אוטופלואורסצנטיות על ידי ציטומטריית זרימה.
      1. ספין כלפי מטה 2 x 10 7 מערכת הפעלה לא מטופלת ובנפרד 2 x 107 OxOS בצינורות מיקרוצנטריפוגות והשהה מחדש ב 1 מ"ל של PBS.
        הערה: קיבוע אינו נדרש אם ציטומטריית זרימה מבוצעת מיד לאחר ההפשרה.
      2. טען דגימות מערכת הפעלה ו-OxOS שלא טופלו על ציטומטר זרימה (ראה טבלת חומרים). התאם פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC) לכפולה מקובלת בתרשים הפיזור FSC-SSC. השתמש PBS כבקרה כדי לשלול חלקיקים קטנים מזהמים. שים לב שמערכת ההפעלה קטנה משמעותית מהתאים.
      3. השתמש בערוץ FITC הסטנדרטי של ציטומטר הזרימה לכימות אוטופלואורסצנטי. ספרו לפחות 10,000 אירועים. השתמש בערך אזור הפולס של היסטוגרמה FITC כדי לייצג את עוצמת הפלואורסצנטיות.
        הערה: במחקר הנוכחי, כל הנתונים מנותחים באמצעות תוכנה לניתוח ציטומטר זרימה (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
    3. הערך את מידת ההצלבה ב- OxOS
      1. סובב כלפי מטה 2 x 10 7 מערכת הפעלה לא מטופלת ובנפרד 2 x 107 OxOS בצינורות מיקרוצנטריפוגה. הסר supernatant ו lyse pellet ישירות על ידי הוספת 1.2x Laemmli Sample Buffer (מספיק כדי לכסות; ראה טבלה של חומרים). מערבולת, לשמור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, להסתובב למטה בטמפרטורת החדר שווה או יותר מ 12000 x גרם במשך 10 דקות, ולאסוף supernatant.
        הערה: הערכת מידת הקישור הצולבות של חלבונים ב- OxOS נותנת תחושה של הלימות הטיפול ב- UV. השוואה נעשית בין מערכת הפעלה לא מטופלת לבין OxOS, וקישור צולב הולם מתרחש כאשר רצועת הרודופסין המונומרית ששולטת בצביעת קומאסי (איור 1C, חץ) פשוט מורגשת, עם הופעה של אגרגטים מסדר גבוה יותר וכתם חלבון בחלק העליון של הג'ל.
        התראה: בעת שימוש במאגר לדוגמה כדי ליזה את מערכת ההפעלה, אל תחמם לאחר מכן את תמיסת הליזיס, מכיוון שהדבר עלול לגרום לצבירת רודופסין. כמו כן, הימנע מקירור מערכת ההפעלה lysed עד מוכן לאחסון, שכן זה יזרז SDS. ליזטים שאינם בשימוש ניתן לשמור ב -20 °C. במקרה של הפשרה מחדש, יש לוודא שהליזטים מופשרים לחלוטין בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
      2. כימות ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון סבילות לריכוזי SDS ורדוקציה גבוהים29. ראה טבלת חומרים לקבלת הצעות לריאגנטים מתאימים לבדיקת חלבון, ופעל לפי פרוטוקול היצרן עבור ריאגנטים אלה.
      3. הפעל דגימות מערכת הפעלה ו-OxOS לא מטופלות באמצעות אלקטרופורזה SDS-PAGE30 על ג'ל הדרגתי של 4%-15%, תוך שימוש במאגר SDS סטנדרטי של טריס-גליצין. הג'ל מופעל במתח של 80 וולט עד שהדגימות נכנסות לערימה, ואז במתח של 120 וולט למשך 50-60 דקות בטמפרטורת החדר.
      4. הכתימו את הג'ל בכחול קומאסי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים31. צביעת קומאסי תדגים את הלימות ההצלבה הנגרמת על ידי טיפול UV.

2. בניית גרגירים דמויי ליפופוצין (UAM) בתרביות RPE

  1. הזנות OxOS: כמות, תדירות ופאגוציטוזה מגשרות על ליגנדות
    הערה: הזנות מתרחשות על תרביות iPSC-RPE או hfRPE אנושיות במעבר 1, שגדלו על פי הפרוטוקול שתואר על ידי מעבדת Bharti (עבור iPSC-RPE)32 או הפרוטוקול שתואר קודם לכן עבור hfRPE, שהותאם ממעבדת שלדון מילר22,23. כל החישובים להלן מבוססים על הזנת OxOS או מערכת הפעלה לטרנסוול אחד בן 24 בארות (קוטר 6.5 מ"מ, 0.33 ס"מ2 שטח גידול).
    1. הפשיר 25 μL של 5.6 x 107 OxOS/mL ב 37 ° C ולהוסיף 45 μL של מדיה תרבית תאים aliquot OxOS, וכתוצאה מכך נפח סופי של 70 μL.
      הערה: אליציטוטים של OxOS שהוכנו בשלב 1 יכילו ליגנדות גישור פאגוציטוזה MFG-E8 וחלבון S. עם זאת, אם ליגנדות אלה לא נוספו לאליציטוטים לפני ההקפאה, ניתן להוסיף אותם בשלב זה, מה שמבטיח שהריכוז הסופי של הליגנדות במדיה להזנת התאים הוא 4 מיקרוגרם/מ"ל עבור חלבון S ו-1.5 מיקרוגרם/מ"ל עבור MFG-E8. כאמור בשלב 1.1.11, ייתכן שיהיה צורך לשנות ריכוזים של ליגנדות גישור עבור סוגי RPE אחרים או צפיפות תאים.
    2. הסר מדיה אפית מ Transwell ולהוסיף 70 μL של 2 x 107 OxOS/mL עם ליגנדות גישור phagocytosis לתא apical . לאחר 24 שעות, הסר והחלף בהזנת OxOS חדשה. האכלה מתרחשת מדי יום במהלך ימי חול, דילוג על סופי שבוע, עד 20 האכלות הושלמו (~ 1 חודש). שינוי מדיה תרבית תאים basolateral (400-550 μL) 2-3x / שבוע.
    3. עם השלמת 20 האכלות, לחדש את שינויי המדיה הרגילים עבור הבאר.
      הערה: נדרשים מספר שינויי מדיה נוספים כדי לשטוף את OxOS הדביק מהמשטח האפי של RPE, כך שניסויים עם תרביות עמוסות UAM חייבים להיעשות לפחות 1-2 שבועות לאחר סיום האכלות OxOS.
      זהירות: חשוב שיהיו בקרות מתאימות להצטברות UAM באמצעות הזנות OxOS. מכיוון ששינויים יומיים במדיה יכולים להשפיע על הביולוגיה של RPE, מומלץ להשתמש בבארות הבקרה הבאות: בקרה 1: החלף מדיה מדי יום במהלך ימי חול עבור אותו מספר האכלות כמו בקבוצה שטופלה ב- OxOS. בקרה 2: הזינו את מערכת ההפעלה RPE ללא טיפול מדי יום במהלך ימי חול באותו ריכוז ונפח כמו הזנות OxOS, עבור אותו מספר האכלות.
  2. ניטור בריאות של תרביות עמוסות בגרגירים דמויי ליפופוסצין על ידי התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל (TEER) ומבחני מוות תאי
    הערה: במהלך ולאחר האכלות OxOS, ניתן למדוד את בריאותן של תרביות RPE על ידי הערכת שלמות RPE בצומת הדוק ומוות תאים. הוכח בעבר כי הערכה של שלמות צומת הדוק, באמצעות מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל (TEER), היא סמן רגיש לבריאות התא הכללית33. ניתן להשתמש גם בסמנים לא פולשניים מסורתיים יותר של מוות תאי, כגון שחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH).
    1. ביצוע TEER
      הערה: TEER נבדק באמצעות מד התנגדות חשמלית טרנס אפיתל (TEER) ואלקטרודת TEER, בדרך כלל בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
      1. כדי לעקר את אלקטרודת TEER, השתמש במגב משימה ספוג באתנול 70% כדי לנקות את האלקטרודה ולאחר מכן לטבול את קצות בדיקת האלקטרודה באתנול 70% למשך 10 דקות.
      2. תן לאלקטרודה להתייבש לחלוטין, ולאחר מכן לטבול את האלקטרודה במדיה סטרילית.
      3. הסר את הגשושית ממדיה סטרילית והכנס את שתי הגשושיות של אלקטרודת TEER לחדרים האפיקליים והבזולטרליים של טרנסוול מתורבת; קצה הבדיקה הארוך יותר מתאים לחדר הבזולטרלי.
        הערה: קל לגרד את החלק התחתון של התא האפי עם אלקטרודת TEER ללא תרגול, וגירוד כזה ישנה באופן דרמטי את קריאות ה- TEER כאשר חד-שכבת RPE משתבשת. לכן, מומלץ למתחילים להתאמן על Transwells לא חשובים לפני בדיקה על תרביות RPE ניסיוניות. יתר על כן, לאחר כל צלחת של תרביות RPE נבדק, הנסיין צריך לבדוק כל גירוד של monolayer RPE תחת מיקרוסקופ תרבית רקמה סטנדרטי.
      4. ברגע שהגשושיות האפיקליות והבזולטרליות נמצאות במקומן בטרנסוול, לחץ על כפתור הקריאה או צעד על מתג הרגל של המונה כדי להקליט את ה- TEER. בין לוחות או קבוצות של תאים, לשטוף את הבדיקה אלקטרודה עם מדיה סטרילית. אם זיהום הוא חשש גבוה, לעקר מחדש בין הצלחות.
      5. חישוב TEER על ידי לקיחת קריאת ההתנגדות מהמטר, חיסור הערך של טרנסוול ריק עם מדיה אך ללא תאים (בדרך כלל 100-110 Ω עבור טרנסוול של 24 בארות עם 0.33 ס"מ2 שטח פנים), ולאחר מכן הכפלה בשטח הפנים של הטרנסוול.
        הערה: יש לדווח על ערכי TEER מנורמלים לשטח הפנים של התא. ערכים אופייניים לתרביות hfRPE בריאות נעים בין 350-1100 Ωcm2. ערכי TEER עולים ככל שהטמפרטורה יורדת. לכן, בעת הסרת תרביות מאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למכסה מנוע בטמפרטורת החדר, ערכי TEER נוטים לעלות על פני הצלחת. כדי להגן מפני שונות זו, עבדו במהירות (אם אתם מנוסים) או המתינו 10-15 דקות עד שטמפרטורת הצלחת תתאזן עם טמפרטורת החדר.
    2. ביצוע בדיקת שחרור LDH
      הערה: שחרור LDH לסופרנאטנט של תרבית תאים מתרחש במהלך מוות תאי ונמדד באמצעות ערכה סטנדרטית (ראה טבלת חומרים).
      1. אוספים את הסופרנאטנט מעל התאים לאחר דגירה של 24 שעות ומדללים ל-1:100 באמצעות מדיה סטנדרטית.
      2. השראת שחרור LDH אפשרי כולל, החשוב לנרמול כל הערכים משלב 2.2.2.1, על ידי הוספה של 2 μL 10% טריטון X-100 ל- 100 μL של מדיה אפית מתאי ביקורת בטרנסוול בן 24 בארות. לאחר הדגירה של תערובת טריטון/תא סופרנאטנט במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C, יש לערבב את המדיה מעל התאים שעברו ליזה ולאסוף כדי למדוד את שחרור ה-LDH הכולל האפשרי.
      3. לאחר איסוף הסופרנאטנטים, בצעו את הבדיקה באמצעות הוראות תקן היצרן, מדידת הארה לאחר דגירה של 30 דקות באמצעות תמיסת החיץ של הערכה.
        הערה: כל ערכי LDH מנורמלים לכמות הכוללת האפשרית של שחרור LDH.
  3. אפיון ספקטרום והרכב גרגירים דמויי ליפופוסצין
    1. רכישת כימות אוטופלואורסצנטי וספקטרום
      1. תקנו תרביות עמוסות UAM עם 4% PFA בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן שטיפת PBS פי 5.
      2. שמור כמות קטנה של PBS בתא האפיקאלי ולאחר מכן הפוך את הטרנסוול הפוך. באמצעות מיקרוסקופ מנתח וסכין גילוח, חתכו את הממברנה הנקבובית למחצה מהטרנסוול, תוך הפעלת כוח חיתוך בצומת הממברנה וטרנסוול.
        הערה: שמור על עקביות לגבי מידת הקרבה לשפה של הטרנסוול שהחתך נעשה, מכיוון שלקרום הטרנסוול יש נטייה להתעקם ולהתקמט כאשר החתכים אינם עקביים.
      3. לאחר חיתוך קרום טרנסוול, הניחו מיד על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות מלקחיים, תוך זהירות להימנע מלגעת בחלקים של קרום טרנסוול עם תאים. יש לסלק עודפי PBS באמצעות ניגוב משימה, תוך הימנעות ממגע בתאים. הוסף מדיית הרכבה ותלוש כיסוי. הקפד לעקוב אחר הצד של הטרנסוול הוא "צד ימין למעלה" בעת כיסוי הטרנסוול.
      4. רכוש את העוצמה והספקטרום האוטופלואורסצנטיים באמצעות אותן הגדרות ופרוצדורות כמו שלב 1.3.1.4 ושלב 1.3.1.5.
        הערה: בעת הדמיה של UAM, בלבול חשוב הוא ש- OxOS הם אוטופלואורסצנטיים ולעתים קרובות נדבקים למשטח האפי RPE במשך ימים ולפעמים אפילו שבועות לאחר השלמת הזנת OxOS. כתוצאה מכך, בעת כימות UAM, יש להשתמש בשיטה כדי להבטיח שאוטופלואורסצנטיות נמדדת מגיעה מ- UAM ולא מ- OxOS. השיטה הקלה ביותר היא להכתים תרביות ליפופוסצין עם נוגדן רודופסין. לדוגמה, נוגדן אנטי-רודופסין 4D2 יכול לשמש בדילול 1:1000 ועם פרוטוקול אימונוציטוכימיה סטנדרטי קיבוע PFA34. הנוגדן המשני לרודופסין צריך להיות נוגדן מצומד בצבע אדום רחוק (למשל עם עירור מקסימלי קרוב ל-647 ננומטר), שכן UAM ו-OxOS autofluorescence נוטים להיות החלשים ביותר באורך גל זה. לאחר מכן ניתן לרכוש תמונות קונפוקליות ברצף בשני ערוצים, ולהלהיב את האוטופלואורסצנטיות של UAM ו-OxOS עם לייזר של 405 ננומטר ופליטה מ-415 ננומטר ל-550 ננומטר, בעוד ששאריות רודופסין, המעידות על OxOS לא מעוכל, יכולות להיות מעוררות באמצעות פרמטרים סטנדרטיים של דימות צבע אדום רחוק בערוץ נפרד. לאחר הרכישה, ערוץ רודופסין יכול לשמש כמסכת חיסור בתוכנית כמו ImageJ כדי להסיר אוטופלואורסצנטיות שמגיעה מ-OxOS דביק שנותר, ולהשאיר מאחור רק אוטופלואורסצנטיות UAM לכמת.
        זהירות: אפילו מערכות הפעלה שאינן מחומצנות פוטו מציגות חלק מהאוטופלואורסצנטיות, ואפילו עם שטיפה קפדנית, חלק ממערכות ההפעלה ו-OxOS נצמדות למשטח ה-RPE. לכן, מבלי ליצור מסכה חיסור באמצעות רודופסין immunostaining, כפי שהוצע לעיל הערה, כימות מדויק של רמות autofluorescence UAM בתרבויות מוזנות OxOs או מערכת הפעלה סטנדרטית אינו אפשרי.
    2. לבצע זיהוי בו זמנית של גרגירים דמויי ליפופוצין וסמנים אימונופלואורסצנטיים אחרים
      הערה: כמפורט בשלב 2.3.1, הספקטרום האוטופלואורסצנטי הרחב של ליפופוסצין מגביל את אפשרויות הצביעה המשותפת של פלואורסצנטיות. ניתן לשקול את השיטות הבאות כדי להקל על צביעה משותפת.
      1. השתמשו בפלואורופור אדום רחוק. Autofluorescence מ lipofuscin חלש אינפרא אדום הקרוב. לכן, שימוש בצבע אדום רחוק לזיהוי פלואורסצנטי של אנטיגן מעניין, בשילוב עם התאמות זהירות של הגדרות התעלה במיקרוסקופ קונפוקלי, יכול בדרך כלל להבחין בין אוטופלואורסצנטיות לבין פלואורסצנטיות של צביעה משותפת.
      2. נצל את זנב הפלואורסצנטיות הארוך של ליפופוסצין.
        הערה: מכיוון שליפופוסצין יש ספקטרום פליטה פלואורסצנטי רחב מאוד, לעתים קרובות הוא יכול להיות מעורר באורך גל ננומטר נמוך (למשל לייזר 405 ננומטר) ועדיין מזוהה פליטה בחלק הכתום/אדום של הספקטרום (למשל 585-635nm). שילוב ייחודי זה של עירור ואורכי גל פליטה יכול לעתים קרובות להיות מותאם סביב פלואורופור מכתים משותף אחר.
        1. זהה את האנטיגן המעניין באמצעות פלואורופור בעל עירור שיא סביב 488 ננומטר, עם זיהוי פליטה ב 500-530 ננומטר. הגדר ערוץ נפרד לזיהוי אוטופלואורסצנטיות עם עירור של 405 ננומטר ופליטה של 585-635 ננומטר. ערוץ שני זה יזהה רק UAM, ואילו הערוץ הראשון יזהה את האנטיגן של עניין בתוספת lipofuscin.
        2. באמצעות תוכנה חופשית כמו ImageJ, השתמש בערוץ השני של UAM בלבד כמסיכת חיסור כדי להסיר את אות ה- UAM מהערוץ הראשון (המכיל הן את אות האנטיגן והן את אות ה- UAM).
      3. השתמש בביטול ערבוב ספקטרלי. רוב המיקרוסקופים הקונפוקליים המודרניים מכילים אפשרות ערבוב ספקטרלית. זה מאפשר אחד לרכוש את הספקטרום של דגימה עם UAM בלבד ודגימה אחרת רק עם פלואורופור מכתים משותף של עניין. לאחר מכן ניתן לרכוש את הדגימה הניסיונית, המכילה הן את UAM והן את פלואורופור הצביעה המשותפת, ולהיות נתונה לשיטות ליניאריות של unmixing כדי לחשב איזה אחוז מהאות הגיע מאוטופלואורסנציה לעומת צביעה משותפת.
        הערה: מדריכים מקיפים לפירוק ערבוב ספקטרלי זמינים ברוב המיקרוסקופים הקונפוקליים המודרניים.
      4. השתמש בהדמיה פלואורסצנטית לכל החיים. בעוד ספקטרום הפליטה בין UAM לבין פלואורופור מכתים משותף עשוי להיות דומה, סביר להניח כי אורך החיים הפלואורסצנטי שלהם שונה באופן משמעותי. באופן כללי, UAM מדגים אורך חיים פלואורסצנטי קצר יותר מאשר רוב הפלואורופורים הספציפיים. עם גישה למיקרוסקופ קונפוקלי המאפשר הדמיה לכל החיים, ניתן לשער אותות פלואורסצנטיים כדי לזהות את אלה שהם ארוכים יותר מאורך החיים הטיפוסי של ליפופוסצין.
        הערה: באופן כללי, אורך החיים הפלואורסצנטי לאותות ארוכים מ-2 ננונים מפחית באופן משמעותי את זיהום ה-UAM, אם כי הוא אינו מבטל לחלוטין את האות.
      5. השתמש במדכא אוטופלואורסצנטי. באופן מסורתי, סודן שחור שימש כדי להרוות autofluorescence לפני צביעה immunofluorescence ספציפי35. מספר מוצרים אוטופלואורסצנטיים זמינים מסחרית מדווחים כדי לשפר את התוצאות של סודן שחור, ומוצרים אלה מפורטים בטבלת החומרים. Autofluorescence מרווה, כמובן, יהרוס את היכולת לזהות lipofuscin.
    3. לקבוע את הרכב של גרגירים דמויי lipofuscin:
      1. להעריך שומנים ניטרליים
        1. תקן בארות RPE ובקרה עמוסות UAM (מוזנות במערכת הפעלה לא מטופלת) ב-4% PFA בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ושטוף עם PBS 5x.
        2. יש לצבוע עבור שומנים ניטרליים באמצעות 10 מיקרוגרם/מ"ל אדום נילוס או 3.33 מיקרוגרם/מ"ל Bodipy 493/503 בתמיסת PBS BSA 3% בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן יש לשטוף עם PBS במשך 5 דקות 3x.
        3. גזור וטען Transwell כמו בשלב 2.3.1.2 ו- 2.3.1.3 ותמונה. באופן כללי, השתמש ברוחב הפס הבא של עירור ופליטה להדמיה: Nile Red - ex 543 nm, em 620-700 nm ו- Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. להעריך כולסטרול אסטרי ולא אסטרי
        1. בצע את שלב 2.3.3.1.1
        2. פיליפין הוא צבע פלואורסצנטי המזהה כולסטרול לא אסטרי, אך לא כולסטרול אסטרי36. לכן, כדי להעריך את כמות הכולסטרול הכולל (unesterified ו esterified) ב UAM, הראשון לטפל מראש את המדגם עם כולסטרול esterase להמיר כולסטרול esterified לתוך כולסטרול unesterified. טפל בתאים עם 20 U/mL כולסטרול אסטראז ב 0.1 M אשלגן פוספט חוצץ (pH 7.2) (ראה טבלה של חומרים) ב 37 ° C במשך 3.5 שעות, ולאחר מכן כביסה עם PBS במשך 5 דקות 3x.
        3. יש לצבוע עם פיליפין 50 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת חומרים) ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולשטוף עם PBS במשך 5 דקות 3x. יש לשמור על הדגימות מכוסות, הרחק מאור, שכן פיליפין מלבין בקלות.
          הערה: אם רוצים לכמת רק כולסטרול לא אסטרי, ניתן לדלג על הכולסטרול אסטראז בשלב 2.3.3.2.2. אם יש לכמת את כמות הכולסטרול האסטרי, ניתן להסיק זאת על ידי ההבדל בין הכולסטרול הכולל לבין הכולסטרול הלא אסטרי במדגם.
        4. גזור והרכיב את Transwell כמו בשלבים 2.3.1.2 ו- 2.3.1.3 ותמונה.
          הערה: בעת הדמיה פיליפין, זה photobleaches מהר מאוד. יש למזער את עוצמת העירור ואת משכו, ולצפות שחלק מההלבנה תתרחש אפילו עם צפייה בדגימה דרך העיניים. לכן, בעת הדמיה, צריך: (1) לחפש אזור מתאים לתמונה באמצעות ערוץ פלואורסצנטי שאינו ערוץ פיליפין, (2) לצלם פיליפין בשדה רחב ולא במיקרוסקופ קונפוקלי (כדי להגביל את עוצמת החשיפה לאור), ו-(3) להימנע מהדמיה חוזרת של אזור. באופן כללי, השתמש ברוחב הפס הבא של עירור ופליטה עבור הדמיה פיליפין - ex 380 nm, em 480 nm.

3. הערכת ההשפעות של גרגירים דמויי ליפופוצין על פגוציטוזה RPE: קיבולת צריכה כוללת

הערה: הרציונל למדידת פגוציטוזה של מערכת ההפעלה באמצעות פרוטוקול הדופק בלבד של מערכת ההפעלה להלן מפורט בסעיף התוצאות המייצגות. השיטה, המכונה "Total Consumptive Capacity", מונעת אי-בהירות לגבי יעילות הפאגוציטוזה שיכולה להופיע עם בדיקות פאגוציטוזה מסורתיות של מערכת ההפעלה. הבדיקות נעשות על לוחות Transwell 24 באר באמצעות 50 μL של מדיה המכילה 4 x 106 OS/mL.

  1. חשב את מספר הבארות הדרושות לניסוי ולאחר מכן הפשיר כמות מתאימה של מערכת הפעלה רגילה, סחרור כלפי מטה ב 2400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשהה מחדש במדיה סטנדרטית של תרבית תאי RPE ל 4 x 106 OS / mL. הוסף ליגנדות גישור כדי להקל על שיעורי phagocytosis.
    הערה: הריכוז הסופי של ליגנדות הגישור במדיה שיש להזין תאים הוא 4 מיקרוגרם/מ"ל עבור חלבון S ו-1.5 מיקרוגרם/מ"ל עבור MFG-E8. כאמור בשלב 1.1.11, ייתכן שיהיה צורך לשנות ריכוזים של ליגנדות גישור עבור סוגי RPE אחרים או צפיפות תאים.
  2. הסר מדיה אפית והוסף 50 μL 4 x 106 OS/mL, רצוי עם ריכוזים מתאימים של ליגנדות גישור.
  3. בזמנים שונים לאחר הוספת מערכת ההפעלה (למשל - 0 שעות, 1 שעות, 4 שעות ו- 24 שעות), הוסף מאגר דגימה של 16.67 μL 4x Laemmli עם מעכבי פרוטאז כדי ליזה את שני התאים ואת מערכת ההפעלה המכילה supernatant. השתמש פיפטה P-200 כדי לגרד את פני השטח Transwell, נזהר לא לנקב את קרום Transwell או לנתק את הממברנה מן Transwell, ולאסוף את התא supernatant משולב בתוספת ליזט התא יחד. מערבלים, מסתובבים, ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לדנטורציה יסודית.
    התראה: למרות השימוש במאגר לדוגמה כדי ליזה את מערכת ההפעלה, אל תחממו לאחר מכן את תמיסת הליזיס, מכיוון שהדבר עלול לגרום לצבירת רודופסין. כמו כן, הימנעו מקירור מערכת ההפעלה עד שהיא מוכנה לאחסון, מכיוון שזה יזרז חלבון. יש להקפיא ליזטים שאינם בשימוש בטמפרטורה של -20°C, ולוודא שליזטים מופשרים לחלוטין לפני השימוש.
  4. הפעל lysates בדף SDS באמצעות אותן הגדרות כמו בשלב 1.3.3, טעינת נפחים שווים של lysates לכל באר. GAPDH, β-אקטין או חלבון משק בית אחר צריכים לשמש לנרמל את מספר התא, מכיוון ששיעורי הפאגוציטוזה תלויים במספר התא.
  5. בדוק כתמים מערביים עם נוגדנים נגד N- או C - terminus של רודופסין. השתמש בתנאי קרישה מערביים סטנדרטיים, ודילול נוגדנים מופיע בטבלת החומרים.
    הערה: מתחת לרצועת הרודופסין הראשית, יהיו מספר קטעי רודופסין. שברים אלה מייצגים רודופסין מעוכל חלקית, תהליך שמתחיל לפני האיחוי של הפאגוזום עם הליזוזום32,33. עלייה במספר מקטעי רודופסין ב-RPE עמוס UAM בהשוואה ל-RPE בקרה יכולה להצביע על פגם במורד הזרם בקיבולת הפאגוליזוזוזומים, ברמה של איחוי פגוזום-ליזוזום, החמצה ליזוזומלית ו/או תפקוד אנזים מתפרק 16,34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההגדרה לחמצון תמונות של מערכת ההפעלה מודגמת באיור 1Ai. השקופיות מצופות פוליטטרה-פלואורואתילן מאפשרות טעינה של נפח גדול של מערכת הפעלה בתמיסה לכל מלבן פתוח מבלי להתפשט על פני שאר השקופית. השקופית עם מערכת ההפעלה נמצאת בתוך צלחת פטרי סטרילית כשהמכסה כבוי, ומנורת UV ממוקמת מעל המגלשה כפי שמוצג באיור 1Aii. לחלופין, ניתן למקם את המגלשה במכשיר UV Crosslinker, כפי שמוצג באיור 1Aiii. לאחר חמצון פוטו, האוטופלואורסנציה של מערכת ההפעלה עולה באופן משמעותי, כפי שהוערך הן על-ידי מיקרוסקופיה והן על-ידי ציטומטריית זרימה (איור 1B). ניתן להעריך את מידת הקישור הצולבות של חלבונים לאחר חמצון פוטו על-ידי SDS-PAGE עם כתם קומאסי, המוצג כהמרה של רצועת החלבונים הדומיננטית (רודופסין מונומרי) לצברים ולמריחה מסדר גבוה יותר (איור 1C). השוואת חמצון פוטו עם מנורת UV ידנית (איור 1Aii) לעומת מכשיר UV Crosslinker (איור 1Aiii) מראה שמנורת UV ידנית מייצרת OxOS עם אותה כמות אוטופלואורסצנטית כמו טיפול 3 J/cm 2 ממכשיר UV Crosslinker (איור 1B), וכמות הצלבת חלבונים זהה לטיפול 6 J/cm2 ממכשיר UV Crosslinker (איור 1C). אם מנורת העל-סגול הזמינה לחוקר שונה מזו המשמשת בפרוטוקול זה, אנו מציעים לטיטר את זמן החשיפה כדי להשיג רמה של קישור צולב שניתן לראות בנתיב מנורות העל-סגול באיור 1C. ספקטרום הפלואורסצנטיות של OxOS מוסט מעט לכחול בהשוואה לספקטרום של מערכת הפעלה לא מטופלת, הן בחלק המבודד חלבוני של מערכת ההפעלה והן בחלק המבודד שומנים של OS16.

כמות הצטברות ה-UAM בתרביות RPE תלויה במספר הזנות ה-OxOS (איור 2A), ו-20 הזנות במהלך כ-4 שבועות מספקות כמות חזקה של הצטברות UAM. כדי להבדיל בין אוטופלואורסצנטיות של UAM לבין אוטופלואורסצנטיות של שאריות OxOS שנשארות דבוקות למשטח האפי RPE גם ימים עד שבועות לאחר השטיפה, אנו מכתימים בנוגדן רודופסין, המזוהה בצבע אדום רחוק. על ידי שימוש בערוץ פלואורסצנטי זה של רודופסין כמסכה, אנו יכולים להחסיר את האוטופלואורסצנטיות של OxOS מערוץ UAM, ולהבטיח שאנו באמת מכמתים אוטופלואורסצנטיות מ- UAMרק 16. תוך שימוש בפרוטוקולי צביעה שתוארו לעיל, UAM מצטבר במודל זה מכיל שומנים ניטרליים בשפע, כפי שהוערך על ידי Nile Red staining16, בדומה לליפופוסין טבעי. אולם אנו מוצאים הצטברות מועטה או לא אסטרית של כולסטרול (איור 2B), אשר עולה בקנה אחד עם חוסר הצטברות כולסטרול שאנו רואים אצל ליפופוסצין טבעי מעיניים בריאות (הנתונים לא מוצגים).

קשה לעקוב אחר סמנים פלואורסצנטיים בעלי עניין במקביל לליפופוסצין אוטופלואורסצנטיות, בהתחשב בספקטרום הפליטה הפלואורסצנטי הרחב מאוד של ליפופוסצין. בסעיף השיטות לעיל, מספר שיטות מפורטות כדי להתגבר על בעיה זו. השיטה המתוארת בשלב 2.3.2.1 לעיל מנצלת את עוצמת הפליטה האוטופלואורסצנטית הנמוכה עבור ליפופוסצין באדום הרחוק. באיור 2Ci, הקולוקליזציה של UAM וסמן האוטופגיה LC3 מוערכת על-ידי צביעת LC3 בצבע Alexa 647. למרות דימום מסוים של UAM לתוך ערוץ LC3, ברור היכן lipofuscin ו LC3 ממוקמים בתמונות אלה. בשיטה המתוארת בשלב 2.3.2.2 לעיל, ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטי הארוך מאוד של ליפופוסצין מאפשר תכנון של תעלת פליטה המכילה פלואורסצנטיות מליפופוסצין בלבד. באיור 2Cii, UAM מעורר באמצעות לייזר של 488 ננומטר, בעוד שהפליטה מזוהה גם ב-500-535 ננומטר וגם ב-600-645 ננומטר. הדגימה מוכתמת במשותף עם LC3, זוהתה בצבע Alexa 488. ערוץ Alexa 488 (עירור: 488 ננומטר, פליטה: 500-535 ננומטר) מכיל גם אות LC3 וגם אות UAM. עם זאת, הערוץ השני, עם עירור 488 ננומטר ופליטה של 600-645 ננומטר, מכיל רק UAM. ערוץ שני זה יכול לשמש כמסיכה, המוחלת על ערוץ Alexa 488/LC3, כדי להחסיר אות UAM לא רצוי מהאות LC3. בשיטה המתוארת בשלב 2.3.2.4 לעיל, אורך החיים הפלואורסצנטי הקצר יותר של ליפופוסצין אוטופלואורסצנטי מאפשר להבחין בין ליפופוסצין לבין פלואורסצנטיות של צביעה משותפת. באיור 2Ciii, כל האותות הפלואורסצנטיים שמגיעים לגלאי ספירת פוטונים לפני 2 ננונים מסולקים, מה ששולל את רוב האות האוטופלואורסצנטי של UAM תוך שימור במידה רבה של אות הצביעה המשותפת מ-LC3. שילוב של שיטות עשוי להיות נחוץ כדי להבחין lipofuscin מ co-staining fluorescence אם יש co-localization חזק של lipofuscin ו co-staining fluorophore.

מכיוון שמחקרים רבים הניחו השפעה של הצטברות ליפופוסצין RPE על שיעורי הפאגוציטוזה של מערכת ההפעלה 5,36,37,38,39, הוערכה יכולת הפאגוציטוזה של מערכת ההפעלה בתרביות עמוסות UAM. בדיקות פגוציטוזה טיפוסיות כוללות דגירה קצרה של תאים עם מערכת הפעלה ("דופק") ואחריה שטיפה של מערכת הפעלה לא מאוגדת והחלפת מדיה ללא מערכת הפעלה לתקופת "מרדף". במהלך המרדף, כאשר מערכת ההפעלה מתפרקת, יש אובדן של רודופסין, החלבון הנפוץ ביותר במערכת ההפעלה, בתוך RPE. בנקודות זמן שונות במהלך המרדף, המדיה נטולת מערכת ההפעלה מוסרת, ואחריה ליזה סלולרית ו-SDS-PAGE עבור רודופסין שנשאר בתוך הליזטים של RPE. עם זאת, מכיוון שתקופת הדופק של מערכת ההפעלה מורכבת הן מספיגה והן מפירוק של מערכת ההפעלה, RPE עם ספיגה והשפלה גבוהות (תאים "יעילים לפאגוציטוזה") עשויים להיות בעלי אותן רמות רודופסין בתחילת תקופת המרדף כמו RPE עם ספיגה והשפלה נמוכות (תאי "פגוציטוזה לא יעילים"). זה מיוצג באופן סכמטי במחקר על ידי Zhang et al23. כדי להתגבר על עמימות זו, נעשה כאן שימוש בבדיקת "דופק בלבד". בשיטה זו, מערכת ההפעלה הם פולסים על RPE אבל לא שטף. בזמנים שונים לאחר הוספת מערכת ההפעלה, המדיה ואת התא lysate נאספים יחד. המדיה מכילה מערכת הפעלה לא מעוכלת והליזט התא מכיל שילוב של מערכת הפעלה שלמה על פני התא, מערכת הפעלה מעוכלת חלקית שהופנמה, ומערכת הפעלה מעוכלת במלואה שהצליחה לעבור דרך הליזוזום. כבקרה, התאים נחשפים למערכת ההפעלה, אבל אז התא ליזט וסופרנאטנט המכיל מערכת הפעלה נאספים מיד. בקרה זו חושפת כמה רודופסין הכולל הוכנס לתאים. מכיוון שליזט פלוס סופרנאטנט נאסף בנקודות שונות לאחר הצגת מערכת ההפעלה, ניתן להעריך איזה חלק מסך אות הרודופסין נעלם, תוך שימוש בזה כסמן לכמות של כל מערכת ההפעלה שהוצגה/החלה וכעת התקלקלה לחלוטין. הקריאה לבדיקה זו מכונה "Total Consumptive Capacity", מכיוון שהיא מודדת במדויק את כל השפלות מערכת ההפעלה ואינה כפופה לפרשנויות המבלבלות של ניסוי מרדף דופק שתואר לעיל.

איור 3A ואיור משלים 1 מדגימים כתם מערבי של רודופסין שנותר באמצעות בדיקת הקיבולת הצרכנית הכוללת. כמות מערכת ההפעלה המוזנת לתאים נמדדת על ידי רצועת רודופסין ב- 0 שעות. רצועת הרודופסין הראשית מתפרקת ביעילות שווה בין דגימות הבקרה לבין דגימות RPE עמוסות UAM (חץ בודד ב-4 שעות ו-24 שעות). עם זאת, יש הבדל בין הקבוצות כאשר מסתכלים על שברי רודופסין מושפלים חלקית, המופיעים מתחת לרצועת הרודופסין הראשית. ההבדלים בשפע המקטעים מרמזים על יכולת ליזוזומלית מופחתת בקבוצת UAM, שכן שברי רודופסין שנקטעו באופן פרוטאוליטי צריכים להתפרק במהירות עם תפקוד ליזוזומלי תקין. שפע מוגבר של שברים אלה ללא שפע מוגבר של מקטע הרודופסין העיקרי מצביע על פגמים עדינים יותר ביכולת השפלה ליזוזומלית בתרבויות עמוסות UAM. מחקרים קודמים הציעו כי ליפופוסצין אכן יכול לגרום לפגמים בפגוציטוזה44 של מערכת ההפעלה, אך אף מחקר קודם לא בדק את ההשפעות של ליפופוסצין באופן ספציפי על מקטעי רודופסין, מה שמאפשר איתור מדויק יותר של חוסר התפקוד לשלבים הסופיים של פירוק פגוליזומלי. איור 3B מדגים כתם מערבי של רצועת הרודופסין הראשית בתוספת מקטעי רודופסין באמצעות שני נוגדנים שונים נגד רודופסין. נוגדן 4D2 מזהה את N-terminus של רודופסין, ומקטעי N-terminal הם החלק האחרון של רודופסין להתפרק בליזוזום. לעומת זאת, נוגדן 1D4 מזהה את C-terminus של רודופסין, אשר מתפרק עוד לפני איחוי phagosome-lysosome. לפיכך, ההבנה אילו שברים מכתימים עם איזה נוגדן מספקת תחושה של פגמים בעיבוד רודופסין שהם טרום ליזוזומליים לעומת ליזוזומליים 32,40,41.

Figure 1
איור 1: טיפול ואפיון של מקטע חיצוני מחומצן בפוטו (OxOS). (A) תיאור של מערכת ההפעלה על שקופית מצופה פוליטטרה-פלואורואתילן (i) שטופלה במנורת כף יד UV 254 ננומטר (ii) או במכשיר UV Crosslinker (iii). (B) בהשוואה למערכת הפעלה לא מטופלת (רגילה) (RegOS), מערכת ההפעלה שטופלה (OxOS) הייתה בעלת עלייה אוטופלואורסצנטית כפי שמוצג על ידי הדמיה קונפוקלית (משמאל) (סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר) וציטומטריית זרימה (מימין). עוצמת ה-Autofluorescent של OxOS שטופלה במנורת UV ידנית הייתה דומה למערכת ההפעלה שטופלה במכשיר UV Crosslinker בחשיפה קורנת של 3 J/cm2 (סרגל שגיאה = S.E.M). (C) SDS-PAGE המדגים את ההצלבה של חלבון מערכת ההפעלה המושרה על ידי חשיפה לקרינת UV. OxOS crosslinking באמצעות מנורת UV כף יד היה דומה למערכת ההפעלה שטופלה עם מכשיר UV Crosslinker בחשיפה קורנת של 6 J / cm2. רודופסין מונומרי מודגש בחץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה של גרגירים דמויי ליפופוסצין המושרים על-ידי OxOS בתרביות hfRPE. (A) גרגירים אוטופלואורסצנטיים (ירוקים) המושרים על-ידי OxOS הצטברו באופן משמעותי יותר לאחר 20 האכלות בהשוואה ל-5 האכלות. כתם OxOS שיורי עם נוגדן רודופסין (מגנטה). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) UAM המושרה על ידי OxOS (ירוק) לא הועשר בכולסטרול חופשי או בכולסטרול אסטר, כפי שהוערך על ידי צביעת פיליפין (אדום). סרגל Scele = 10 מיקרומטר. (C) שיטות הדמיה לצביעה משותפת פלואורסצנטית בנוכחות ליפופוסצין. (i) שימוש בפלואורופור אדום רחוק (Alexa 647) כדי להכתים סמן אוטופגיה LC3 (מגנטה), אשר ממזער דימום UAM. תמונה טהורה של UAM (ירוק) עם הגדרת מסנן עירור ופליטה סטנדרטי של ערוץ ירוק. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. (ii) שימוש בהדמיה רציומטרית מסייע בפענוח אוטופלואורסצנטיות של UAM מצביעת LC3 המסומנת ב-Alexa 488. העירור הוא 488 ננומטר, פס הפליטה של הערוץ הירוק הוא 500-535 ננומטר ואילו פס הפליטה של הערוץ האדום הוא 600-645 ננומטר. ניתן להחיל ערוץ אדום כמסיכת חיסור כדי לבודד אות LC3 מהערוץ הירוק. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (iii) מכיוון שאורך החיים הפלואורסצנטי של ליפופוסצין/UAM הוא בדרך כלל קצר יותר מצבעים ספציפיים, ניתן להפחית את הפלואורסצנטיות של UAM על ידי הוצאת אותות פלואורסצנטיים המגיעים לגלאי ספירת פוטונים תוך פחות מ-2 ns. התמונה העליונה היא ללא גידור. התמונה התחתונה היא עם גטינג, שמירה רק על אותות פלואורסצנטיים עם אורך חיים ארוך מ -2 ns. יש ירידה יחסית גדולה יותר באות UAM בהשוואה לאות LC3 ספציפי (המסומן עם Alexa 488) בין התמונות העליונות והתחתונות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שיטת "Total Consumptive Capacity" למדידת פגוציטוזה של מערכת ההפעלה. (A) סך כל חלבון הרודופסין שנותר הן בליזט התא והן בסופרנאטנט לאחר החדרת מערכת ההפעלה לתרבית RPE, כפי שנבחן על ידי כתם מערבי. לאחר הזנת מערכת ההפעלה הרגילה במדיה של 50 μL, הן המדיה המותנית / supernatant והן התאים היו lysed יחד ב 0, 4, ו 24 שעות. נקודת הזמן של 0 שעות משמשת כבקרה, המציינת את הכמות הכוללת של מערכת ההפעלה המוזנת לכל Transwell. רצועת הרודופסין השלמה (חץ יחיד) לא הייתה שונה בין תאי RPE עמוסי בקרה לתאי RPE עמוסי UAM, מה שמרמז על כך שלא הייתה השפעה גדולה של UAM על פגוציטוזה של RPE. עם זאת, תוצרי המחשוף של רודופסין, המסומנים על ידי החיצים הכפולים, היו גבוהים יותר בקבוצת UAM, מה שמרמז על תפקוד לקוי קל במערכת הפגוליזומלית. רמות שוות של GAPDH מצביעות על כך שספירת התאים בין בארות, שיכולה להשפיע על שיעורי הפאגוציטוזה, הייתה שווה. (B) נוגדני רודופסין שונים מזהים מקטעי פירוק שונים. 4D2 מזהה את N-terminus של רודופסין, אשר שלם עד השלבים האחרונים של השפלה ליזוזומלית. לכן השברים שהוא מזהה הם קטנים (חיצים כפולים). לעומת זאת, 1D4 מזהה את מסוף C של רודופסין, אשר מתפרק מוקדם יותר בתהליך הפגוליזומלי. נוגדן זה מזהה אפוא מקטעי רודופסין בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר (חצים כפולים). שני הנוגדנים מזהים רודופסין שלם (חץ בודד). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: כתם לא ערוך המתאים לאיור 3A. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעוד RPE lipofuscin נחקר במשך עשרות שנים, רעילותו שנויה במחלוקת 2,9,16,42. בהינתן עמימות לגבי הרעילות של ליפופוסצין ממודלים של בעלי חיים11, מודלים במבחנה המשתמשים ב- RPE אנושי הם בעלי ערך. מגוון מודלים של הצטברות ליפופוסצין במבחנה תוארו, אך אף אחד מהם לא השתמש הן בהזנת מערכת ההפעלה והן בתרבויות RPE אנושיות בוגרות ומובחנות מאוד. שילוב זה מייצג מודל אידיאלי, שכן הזנת מערכת ההפעלה משחזרת את השיטה להצטברות ליפופוסצין in vivo ותרביות RPE אנושיות בוגרות מאוד משכפלות בצורה הטובה ביותר התנהגות RPE in vivo. באופן מעניין, כאשר השתמשו בתרביות hfRPE מובחנות מאוד, התגלה כי חשיפה שגרתית למערכת ההפעלה לא הייתה מספיקה כדי לגרום לחומר דמוי ליפופוסצין, אפילו לאחר האכלות חוזרותונשנות 16. לפיכך, פרוטוקול זה מאיץ את תהליך הצטברות ליפופוסצין על ידי פוטו-חמצון OS (OxOS) בצורה מבוקרת. הזנת OxOS הן בתרביות iPSC-RPE והן בתרביות hfRPE אנושיות הביאה להצטברות חזקה של גרגירים דמויי ליפופוסצין, המכונה חומר אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול (UAM). הצטברות UAM מאפשרת מידול של ליפופוסצין במערכות תרבית המחקות RPE אנושי בריא in vivo 22,23,29,43,44. הן בפרסום קודם והן במחקר זה, אפיון נרחב של UAM בהשוואה לליפופוסצין יליד מבוגרים בריאים מדגים דמיון והבדלים. UAM מחקה את מבנה העל של ליפופוסצין in vivo, כולל הנטייה של גרגרי ליפופוסצין להתמזג עם גרגרי מלנין ליצירת מלנוליפופוסצין16. גם UAM וגם ליפופוסצין מכילים שומנים ניטרליים משמעותיים, ללא רודופסין, וללא העשרה משמעותית בכולסטרול (איור 2A,B מהפרסום הקודם שלנו16, איור 2A,B לעיל, ונתונים שלא פורסמו). השווינו גם את גודל וספקטרום גרגרי ליפופוסצין המקוריים לאלה של UAM (איור 3 מהפרסום הקודם שלנו16). גרגרי UAM הם בתחילה מעט גדולים יותר ומוסטים לכחול בהשוואה לליפופושצין טבעי, אך לאורך תקופות זמן משמעותיות בתרבית, ה- UAM קומפקטי לגודל קטן יותר והיסט לאדום בספקטרום הפליטה שלהם, והופך להיות דומה הרבה יותר לגודל ולפרופיל הספקטרום של ליפופוסין טבעי.

מודל OxOS UAM שימש למגוון יישומים, כולל ההשפעות של השראות אוטופגיה על מניעה והסרה של גרגרי ליפופוסצין50 וההשפעות של ליפופוסצין על קוטביות RPE ומטבוליזם16. יתר על כן, גרגירים אלה הוכחו כעמידים בתרבית RPE במשך יותר משנה, מה שמאפשר לחקור את האבולוציה של ספקטרום ליפופוסצין, מורפולוגיה והתנהגות לאורך תקופות זמן ממושכות16. יישומים אחרים למודל כוללים מחקר של הצטברות ליפופוסצין על הפעלה משלימה51, יציבות ליזוזומלית ותגובות דלקתיות 52, ופשרה מיטוכונדריאלית53.

ישנם מספר שלבים קריטיים לפרוטוקול זה. ראשית, תרבויות RPE צריכות להיות מאוד מובחנות ובוגרות. הזנות OxOS צריכות להתחיל רק לאחר ש-RPE היה על Transwells לפחות 8 שבועות והשיג את כל התכונות האופייניות ל-RPE בוגר מאוד (5 'P's שפורטו על ידי Finnemann et al. - מצולע במורפולוגיה, פוסט-מיטוטי, פיגמנט, מקוטב ופאגוציטי54). שנית, מערכת ההפעלה שברירית מאוד ויש לטפל בה בזהירות במהלך הפיפט. הצנרת מוגזמת או הפשרת הקפאה יפרקו את מערכת ההפעלה. לבסוף, היחס בין מערכת ההפעלה לחשיפה הכוללת לשטף UV הוא קריטי ליצירת OxOS שנשארת שלמה אך עדיין יכולה לגרום ל- UAM; יחס זה שוכלל בפרוטוקול זה. יותר מדי אור UV עבור מספר נתון של מערכות הפעלה גורם לקישורים צולבים מוגזמים והורס מבנים כימיים קריטיים במערכת ההפעלה. מעט מדי אור UV עבור מספר נתון של מערכת הפעלה לא יצליח לגרום ל- UAM בתרבית.

שינויים בפרוטוקול כרוכים בעיקר בשינוי משך ההזנה או הריכוז של OxOS. אמפירית, 20 האכלות במהלך כ -4 שבועות מייצרות כמות חזקה של הצטברות UAM. האכלות מעבר לכך עשויות להוסיף בהדרגה להצטברות UAM, בעוד שפחות האכלות צפויות לגרום רק להצטברות UAM ספורדית. ניתן להתאים את מספר ההזנות בהתאם למטרה, לצרכים ולמשאבים של הניסוי והנסיין. בתרביות RPE פחות ממוינות (מספר מעבר גבוה יותר, קווי תאים, או תרביות המדגימות תכונות מעבר אפיתל-מזנכימליות), יש צורך בפחות האכלות ובריכוזי OxOS נמוכים יותר להשראת UAM חזקה.

לפרוטוקול מספר מגבלות. שימוש במנורת UV ידנית לחמצון אור של מערכת ההפעלה מונע כימות מדויק של החשיפה הכוללת לקרינה המועברת למערכת ההפעלה. אולם חמצון פוטו של מערכת ההפעלה באמצעות מנורת כף היד נמצא בקורלציה במחקר זה להתקן UV Crosslinker יקר בהרבה (אך כמותי) באיור 1 כדי לסייע באספקת פרמטרים לחשיפה לקרינה. מומלץ לנסיינים לשנות את משך החשיפה לקרינת על-סגול עד שדפוס המריחות הצולב/רודופסין יחקה את זה שנראה בעמוד מנורת העל-סגול של הכתם המערבי באיור 1C.

מגבלה שנייה של השיטה היא שהיא ככל הנראה חסרה רבות מהתכונות של הצטברות ליפופוסצין in vivo. ואכן, לאורך כל הפרוטוקול הזה, הגרגירים דמויי הליפופוצין מכונים חומר אוטופלורוסצנטי בלתי ניתן לעיכול (UAM) כדי להבהיר הבחנה זו. מערכת ההפעלה לחמצון פוטו משחזרת חלק מהקשרים הצולבים הכימיים הטבעיים המתרחשים במקטעים חיצוניים של קולטני אור במצבי מחלה, אך הקישור הצולב מואץ מאוד וככל הנראה יותר לא ספציפי במודל UAM. יתר על כן, למרות כמעט חודש של הזנות OxOS, מודל UAM עדיין מייצג חשיפה "חריפה" למערכת ההפעלה הגורמת לליפופוצין, בהשוואה לעשורים שלוקח לליפופוסצין להצטבר בבני אדם. עם הצטברות ליפופוסצין ממושכת יותר בתרבית, ייתכנו פחות השפעות פנוטיפיות. עם זאת, מכיוון שגרגירי UAM נמשכים יותר משנה במערכת התרביות המוצגת כאן, יש הזדמנות ללמוד את ההשפעות ארוכות הטווח שלהם על בריאות RPE16.

מגבלה של שיטת "Total Consumptive Capacity" המוצגת כאן להערכת קיבולת פגוציטוזה RPE היא שהיא אינה מבחינה אם פגמים בפאגוציטוזה עשויים לנבוע מקשירה של מערכת ההפעלה לעומת ספיגה לעומת התפרקות. ואכן, כאשר המטרה של בדיקת הפאגוציטוזה היא תובנה מכניסטית לגבי תפקוד לקוי של שלבים ספציפיים בתהליך הפאגוציטוזה, מבחני מרדף הדופק המסורתיים של מערכת ההפעלה מתאימים יותר. יש להשתמש במדידה של "קיבולת צריכה כוללת" כאשר המטרה היא פשוט למדוד באופן חד משמעי את יכולת הפאגוציטוזה של מערכת ההפעלה של תרבות RPE תחת בקרה לעומת תנאי ניסוי.

לסיכום, מוצג פרוטוקול להצטברות גרגירים דמויי ליפופוצין בתרביות RPE אנושיות מובחנות מאוד. שיטה זו ממזגת את התהליך הפיזיולוגי להצטברות ליפופוסצין - הזנות חוזרות ונשנות של מערכת הפעלה מחומצנת לאור - עם מודלים של תרביות RPE שהוכחו במחקרים חוזרים ונשנים כמחזירים חזק RPE in vivo אנושי. התרביות המתקבלות עמוסות בגרגירים דמויי ליפופוסצין יכולות לשמש למגוון יישומים, החל מהערכת השפעות ליפופוסצין על ביולוגיה של RPE ועד בדיקות של מולקולות קטנות, גנים ומסלולי איתות החשובים לוויסות הצטברות ליפופוסצין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת, בחלקה, על ידי מענקים מהקרן לניתוחי זגוגית-רשתית (VRSF), Fight for Sight (FFS) והקרן הבינלאומית לחקר הרשתית (IRRF). J.M.L.M. נתמכת כיום על ידי מענק K08 מהמכון הלאומי לעיניים (EY033420). לא נעשה שימוש בכספים פדרליים למחקר HFT. תמיכה נוספת מגיעה מיוזמת ג'יימס גרוספלד עבור AMD יבש ומהתורמים הפרטיים הבאים: ברברה דאן ודי ודיקסון בראון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, Clifton, N.J. 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, Clifton, N.J. 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. 0, 51-60 (2014).

Tags

ביולוגיה גיליון 194 ליפופושצין אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) קצוות או שברי מקטע חיצוני של קולטני אור (OS) פגוציטוזה מחלת סטארגארדט ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) חומר אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול (UAM)
מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. … More

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter