Vi presenterar ett tvåstegsprotokoll för högkvalitativ mitokondriisolering som är kompatibel med proteinupptäckt och kvantifiering i proteomskala. Vårt protokoll kräver ingen genteknik och är därför lämpligt för att studera mitokondrier från alla primära celler och vävnader.
De flesta fysiologiska och sjukdomsprocesser, från central metabolism till immunsvar mot neurodegeneration, involverar mitokondrier. Det mitokondriella proteomet består av mer än 1000 proteiner, och överflödet av var och en kan variera dynamiskt som svar på yttre stimuli eller under sjukdomsprogression. Här beskriver vi ett protokoll för att isolera högkvalitativa mitokondrier från primära celler och vävnader. Tvåstegsförfarandet omfattar (1) mekanisk homogenisering och differentialcentrifugering för att isolera råa mitokondrier och (2) taggfri immuninfångning av mitokondrier för att isolera rena organeller och eliminera föroreningar. Mitokondriella proteiner från varje reningssteg analyseras med kvantitativ masspektrometri och anrikningsutbyten beräknas, vilket möjliggör upptäckt av nya mitokondriella proteiner genom subtraktiv proteomik. Vårt protokoll ger ett känsligt och omfattande tillvägagångssätt för att studera mitokondriellt innehåll i cellinjer, primära celler och vävnader.
Mitokondrier är komplexa och dynamiska organeller som kan känna av och anpassa sig till cellens metaboliska behov. Centralt för komplexiteten i cellulär metabolism fungerar mitokondrier som metaboliska nav där kolhydrat-, protein-, lipid-, nukleinsyra- och co-faktormetabolismreaktioner konvergerar1. De fungerar också som signalorganeller för vägar för det medfödda immunsvaret och som svar på förändringar i joner och reaktiva syrearter 2,3. Hittills har cirka 1 100 proteiner kartlagts till mitokondrier 4,5,6, men vi kan anta att många fler återstår att upptäcka, särskilt de som endast uttrycks i vissa celltyper eller tillfälligt under specifika miljöförhållanden. Att utveckla nya metoder för att kvantifiera förändringar i mitokondriell sammansättning i metaboliska tillstånd av intresse kommer att öka vår kunskap om dessa organeller och belysa nya terapeutiska vägar för de störningar som kännetecknas av mitokondriell dysfunktion7.
För närvarande finns olika mitokondriisoleringsprotokoll tillgängliga, med olika utbyten och renhetsnivåer8. Centrifugeringsbaserade metoder är de mest populära på grund av deras enkelhet och låga kostnader. Även om differentialcentrifugering är lämplig för de flesta tillämpningar, har den nackdelen att den uppnår lägre mitokondriell renhet och kräver stora mängder utgångsmaterial när mer komplexa densitetsgradientbaserade applikationer används. Under senare år har nya metoder för mitokondriisolering dykt upp, såsom tag-based immune capture (“MITO-IP”)9 och fluorescensaktiverad organellsortering10. Även om båda förfarandena kan generera prover med hög renhet, kräver den förra genteknik för att märka mitokondrier för affinitetsrening, vilket gör protokollen oförenliga med primärmaterial från omodifierade organismer eller mänskliga givare. Under tiden är den senare beroende av tillgång till flödescytometri och sorteringsinstrument. Att kombinera olika isoleringsmetoder ger löfte om att generera mer robusta protokoll och ökad renhet.
Här presenterar vi ett nytt protokoll för mitokondriisolering baserat på kombinationen av två befintliga metoder: (1) differentiell centrifugering för att isolera en rå mitokondriell fraktion, och (2) tagfri immuninfångning av mitokondrier med superparamagnetiska pärlor kovalent bundna till antikroppar mot translokas av yttre mitokondriellt membran 22 (Tomm22)11, ett allestädes närvarande mitokondriellt yttermembranprotein (Figur 1). Förfarandet vi beskriver är kompatibelt med kvantitativ proteinmasspektrometri, och eftersom det är taggfritt och inte kräver genetisk manipulation kan det tillämpas på ett brett spektrum av forskningsmodeller, från cellinjer till kroppsvätskor till hela djurvävnader. Dessutom möjliggör användningen av två steg i protokollet användningen av subtraktiv proteomik 6,12 för upptäckt av nya mitokondriella proteiner och studier av deras uttryck.
Vi har kombinerat differentialcentrifugering och immunocapture för att uppnå en förbättrad renhet för mitokondriisolering. Vår procedur ger tillgång till primärmaterial för identifiering och karakterisering av nya mitokondriella proteiner. Protokollet är enkelt och robust och kan tillämpas på cellinjer, primära celler och vävnader utan behov av genetisk modifiering. Vi har validerat vårt protokoll genom immunoblot- och proteomikanalyser på prover tagna i olika steg under reningsproceduren.
I jämförelse med enstaka isoleringsmetoder genererar kombinationen av anrikningssteg av olika slag – här centrifugering och immunmärkning – ett mer robust protokoll för att isolera mitokondrier. Detta beror på att medan mitokondriella proteiner kommer att anrikas i båda reningarna, är det osannolikt att föroreningar också kommer att anrikas efter båda anrikningsstegen. Även om hög mitokondriell renhet också kan uppnås genom ultracentrifugering av densitetsgradient, kräver detta tillvägagångssätt en stor mängd utgångsmaterial och tillgång till en ultracentrifug. Slutligen, i motsats till de senaste metoderna baserade på taggbaserad mitokondriell isolering20, kräver vårt tillvägagångssätt inte genetisk modifiering av provet, vilket gör det lämpligt för primärmaterial från vilken källa som helst.
Vissa tekniska och biologiska överväganden måste beaktas i den experimentella designen när vi tillämpar vårt protokoll. (1) Mängden utgångsmaterial är avgörande för att få tillräckligt med material. Oundvikligen kommer ett litet antal mitokondrier att gå förlorade under homogenisering (steg 3.10), eftersom inte alla celler lyseras, eller under tvättarna med tre kolonner (steg 4.6). Medan vårt protokoll fokuserar på renhet över avkastning, har effektiviteten av mitokondriernas isolering, och därmed deras utbyte, inte mätts eller optimerats. Att använda fler Tomm22-pärlor och fler kolumner förväntas öka utbytet av mitokondrieråterhämtning. Samtidigt kan en grundlig optimering av homogeniseringssteget också leda till förbättrat mitokondriellt utbyte. Detta protokoll och de initiala cellnumren vi rapporterar här för RAW264.7-celler och BMDM är lämpliga för proteomik och kan justeras för andra applikationer. När det gäller primära BMDM fann vi att en enda mus var tillräcklig för en replikat. Vid behov kan proceduren skalas upp för att isolera BMDM från flera djur, som sedan kan slås samman för att få tillräckligt med material. Cellnumret kan optimeras beroende på celltyp, dess storlek och dess mitokondriella innehåll. (2) Tomm22 uttrycks på mitokondrier från alla celltyper och vävnader21, men uttrycksnivån kan variera. När man utformar ett experiment för att jämföra olika förhållanden är det därför viktigt att se till att uttrycksnivåerna för Tomm22 är jämförbara. På grund av det allestädes närvarande uttrycket av Tomm22 är det inte möjligt att studera celltypspecifika mitokondriella proteiner i komplexa vävnader. (3) Den tid som krävs för att generera rena mitokondrier (cirka 2,5 timmar) är oförenlig med en studie av övergående händelser, såsom förändringar i metaboliska profiler. I det här fallet rekommenderar vi direkt taggbaserad immunfångst9, vilket också gör det möjligt att studera celltypspecifika mitokondrier in vivo20. (4) Även om studier på isolerade mitokondrier som erhållits med enbart Tomm22-antikroppsmärkta pärlor har visat aktivitet i funktionella analyser11återstår det att avgöra om mitokondrier som genereras med vårt protokoll är kompatibla med aktivitetsbaserade analyser nedströms. MitoTracker eller tetrametylrhodamin metylesterperklorat (TMRM) färgning, eller respirometrimätningar, är potentiella metoder för att kvantifiera funktionaliteten hos isolerade mitokondrier22. (5) Efter att ha eluerat det “mitorena” provet från kolonnen kommer några Tomm22-pärlor att finnas i den rena mitokondrifraktionen (Figur 2B). Även om vi inte har observerat någon interferens med trypsinuppslutning och proteinmasspektrometri, bör förekomsten av dessa pärlor och immunglobulinerna beaktas i andra nedströmsapplikationer. Tomm22-antikroppen är en monoklonal antikropp som produceras hos möss23, och därför är det viktigt att komma ihåg att när man använder sekundära antikroppar mot möss i immunoblot, kommer det att generera ospecifika band vid storleken på immunglobulinkedjorna. (6) Fullständig homogenisering av cellsuspensionen är nyckeln till framgångsrik isolering av mitokondrier. Här använder vi en spruta med en 25 G nål för att lysera både RAW264.7-celler och BMDM. Beroende på celltypen och dess storlek kan emellertid andra mekaniska homogeniseringsmetoder, såsom användning av en Dounce-homogenisator, eller mer kontrollerade tillvägagångssätt som cellhomogenisatoranordningar, vara mer lämpliga. Icke-mekaniska homogeniseringsmetoder, såsom mild ultraljudsbehandling, kan också övervägas. Vävnadshomogeniseringsmetoder diskuteras vidare i andra studier24,25. (7) Även om validering genom immunoblot är den enklaste och billigare metoden, korrelerar resultaten inte alltid med förändringar på organellnivå. Det är därför vi rekommenderar att du använder proteomik för att fullt ut validera anrikning eller utarmning av mitokondrier respektive andra organeller.
Det tvåstegs mitokondriernas reningsprotokoll som beskrivs här har gjort det möjligt för oss att generera sekventiella prover med ökande mitokondriell renhet, och detta har gjort det möjligt för oss att upptäcka nya mitokondriella proteinkandidater genom subtraktiv proteomik12. För vår analys använder vi stränga tröskelvärden för att välja för signifikant anrikade mitokondriella proteiner, och även om detta kan misslyckas med att identifiera några kända mitokondriella proteiner (Figur 3A), minskar den falskt positiva hastigheten för ny mitokondriell proteinupptäckt. Det är dock viktigt att betona att alla kandidatproteiner som avslöjas av vårt protokoll måste valideras genom ortogonala metoder. Vi rekommenderar karboxiterminal GFP-märkning eller användning av antikroppar mot det endogena proteinet för att validera samband med mitokondrier antingen mikroskopiskt eller genom proteasskyddsanalyser.
Den direkta tillämpningen av vår metod när det gäller omodifierade celler och vävnader erbjuder ett kraftfullt verktyg för att undersöka hur mitokondrier förändras och anpassar sig till sin miljö vid friska och sjukdomstillstånd. Tillämpning av vårt protokoll på cellinjer, djursjukdomsmodeller, mänskliga vätskor och till och med biopsier från kirurgi kan visa sig vara särskilt användbara för att förbättra vår förståelse av mitokondrier och deras associerade störningar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Manfredo Quadroni, Protein Analysis Facility och Electron Microscopy Facility vid University of Lausanne för deras hjälp. Vi tackar också H.G. Sprenger, K. Maundrell och medlemmar av Jourdain-laboratoriet för råd och feedback på manuskriptet. Detta arbete stöddes av stiftelsen Pierre-Mercier pour la Science och Swiss National Science Foundation (projektbidrag 310030_200796).
1 mL syringe | BD Plastipal | 309628 | |
25 G Needle | BD Microlance | 300400 | |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
Anti-TOM22 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-127-693 | |
Cell scraper | FisherScientific | 11577692 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | ThermoFisher | 31966 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | FisherScientific | BP-120-1 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | |
HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
LS columns and plungers | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Macrophage colony-stimulating factor | Immunotools | 12343115 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
Sucrose | Sigma | S1888 | |
Penicillin/Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
Petri dishes | Corning | BH93B-102 | |
Phosphate-buffered saline 10X | Eurobio Scientific | CS3PBS01-01 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | C19196 |