यह रिपोर्ट रक्त-मस्तिष्क बाधा मॉडल के निर्माण के लिए μSiM प्लेटफ़ॉर्म पर असेंबली, सेल कल्चर और परख के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करती है।
माइक्रोसिम (μSiM) रक्त-मस्तिष्क बाधा (BBB) मॉडलिंग के लिए एक झिल्ली-आधारित संस्कृति मंच है। पारंपरिक झिल्ली-आधारित प्लेटफार्मों के विपरीत, μSiM प्रयोगवादियों को नई क्षमताओं के साथ प्रदान करता है, जिसमें लाइव सेल इमेजिंग, ‘रक्त’ और ‘मस्तिष्क’ कक्षों के बीच निर्बाध पैराक्रिन सिग्नलिंग, और झिल्ली के निष्कर्षण / रिमाउंटिंग की आवश्यकता के बिना सीधे इम्यूनोफ्लोरेसेंस की छवि बनाने की क्षमता शामिल है। यहां हम अल्ट्राथिन नैनोपोरस सिलिकॉन-नाइट्राइड झिल्ली का उपयोग करके बीबीबी के मोनोकल्चर (एंडोथेलियल कोशिकाओं) और सह-संस्कृति (एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट्स) मॉडल को स्थापित करने के लिए मंच के बुनियादी उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। हम प्राथमिक सेल संस्कृतियों और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) संस्कृतियों दोनों के साथ संगतता प्रदर्शित करते हैं। हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के माध्यम से बीबीबी मॉडल के गुणात्मक विश्लेषण के लिए तरीके प्रदान करते हैं और एक छोटे अणु पारगम्यता परख में बाधा समारोह के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए μSiM के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। प्रदान की गई विधियों को उपयोगकर्ताओं को मंच पर अपने बाधा मॉडल स्थापित करने में सक्षम बनाना चाहिए, मानव ऊतकों का अध्ययन करने के लिए ऊतक चिप प्रौद्योगिकी के उपयोग को आगे बढ़ाना चाहिए।
जीवित ऊतकों को विशेष कोशिकाओं द्वारा विभाजित किया जाता है जो बाधाओं को बनाते हैं और बनाए रखते हैं और विनियमित करते हैं कि किन कोशिकाओं और अणुओं को एक डिब्बे से दूसरे डिब्बे में ले जाया जाता है। बाधा कार्यों का अनुचित विनियमन तीव्र बीमारियों और पुरानी बीमारी दोनों का स्रोत हो सकता है। रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) मानव शरीर में सबसे प्रतिबंधात्मक ऊतक बाधाहै। बीबीबी की शिथिलता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की बीमारियों की एक विस्तृत श्रृंखला को रेखांकित करती है, जिसमें अल्जाइमर रोग2, पार्किंसंस रोग 3,4, और मल्टीपल स्केलेरोसिस 5,6 शामिल हैं। बीबीबी को चोट भी तीव्र विकारों के परिणामस्वरूप दीर्घकालिक संज्ञानात्मक हानि से जुड़ी हुई है, जैसे कि सेप्सिस7, सीओवीआईडी -198, और पोस्टऑपरेटिव डेलीरियम9। मस्तिष्क विकारों का इलाज करने की क्षमता वाली दवाओं का विकास निराशाजनक रूप से मुश्किल हो गया हैक्योंकि मस्तिष्क में लक्ष्य के लिए बायोएक्टिव अणुओं को वितरित करने के लिए बीबीबी को जानबूझकर तोड़ने की चुनौती है। इन कारणों से, इन विट्रो में बीबीबी फ़ंक्शन का अध्ययन करने के तरीके सीएनएस के रोगों की समझ और उपचार के लिए सर्वोपरि महत्व के हैं।
विट्रो में बाधा समारोह को मापने के लिए बुनियादी तरीकों में एक अर्ध-पारगम्य झिल्ली पर एक मोनोलेयर या सह-संस्कृति की स्थापना और कोशिकाओं द्वारा छोटे अणु प्रसार या छोटी विद्युत धाराओं 11,12,13,14 के लिए प्रदान किए गए प्रतिरोध को मापना शामिल है। जबकि माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) के उद्भव ने 3 डी15,16 में बीबीबी मॉडलिंग के लिए विकल्पों की बहुतायत का उत्पादन किया है, सिस्टम ज्यामिति की विविधता एमपीएस या स्थापित साहित्य मूल्यों के बीच पारगम्यता माप की तुलना करना मुश्किल बनाती है। विश्वसनीय आधारभूत मूल्यों की स्थापना बीबीबी अनुसंधान में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जहां मस्तिष्क संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा व्यापक बाधा विनियमन के कारण, इन विट्रो पारगम्यता मूल्यों की अत्यधिक जांच की जाती है12,17,18. इन कारणों से, 2 डी झिल्ली पर स्थापित मोनोलेयर में पारगम्यता माप आने वाले वर्षों के लिए बीबीबी अध्ययनों में एक प्रमुख बने रहेंगे। यह उपकला बाधाओं सहित अन्य ऊतक बाधाओं के लिए सच है, जहां बेसलाइन पारगम्यता के पूर्ण मूल्यों का उपयोग इन विट्रो मॉडल 19,20,21 को मान्य और तुलना करने के लिए किया जाता है।
बीबीबी अनुसंधान समुदाय के लिए एक मूल्यवान नए उपकरण की स्थापना के लक्ष्य के साथ, हमने पिछले 5 वर्षों में बैरियर टिशू मॉडलिंग में उपयोग के लिए 22 और उन्नत23,24,25,26 माइक्रोडिवाइस पेश किए हैं, जिसमें एक सीलिकॉन एमएम्ब्रेन (μSiM) प्लेटफॉर्म है। मंच की सक्षम विशेषता एक अल्ट्राथिन (<100 एनएम मोटी) झिल्ली है जिसमें सैकड़ों लाखों नैनोपोर्स27,28 या नैनोपोर्स और माइक्रोपोर्स29 का मिश्रण है। फ्री-स्टैंडिंग मेम्ब्रेन चिप्स का उत्पादन 300 μm सिलिकॉन ‘चिप’ पर किया जाता है जो अल्ट्राथिन संरचनाओं को स्थिर करता है30 और उन्हें डिवाइस असेंबली के लिए चिमटी द्वारा नियंत्रित करने की अनुमति देता है। उनकी अल्ट्राथिन प्रकृति के कारण, झिल्ली में एक पारगम्यता होती है जो वाणिज्यिक झिल्ली संस्कृति उपकरणों31,32 में उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक ट्रैक-अंकित झिल्ली की तुलना में परिमाण के दो क्रम अधिक होती है। व्यवहार में, इसका मतलब है कि नैनोपोर्स (<60 एनएम) से छोटे अणुओं के प्रसार के लिए झिल्ली की बाधा नगण्यहै। इस प्रकार, सेलुलर बाधाओं के लिए, केवल कोशिकाएं और उनके द्वारा जमा किए गए मैट्रिसेस एपिकल से बेसल डिब्बों तक छोटे अणु परिवहन की दर निर्धारित करेंगे जो झिल्ली34 द्वारा अलग किए जाते हैं। डिवाइस डिजाइन और झिल्ली की अल्ट्राथिन प्रकृति भी ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए कई फायदे प्रदान करती है। इनमें 1) चरण कंट्रास्ट या उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग का उपयोग करके लाइव संस्कृतियों का पालन करने की क्षमता, 2) झिल्ली को कवर ग्लास में निकालने और स्थानांतरित करने की आवश्यकता के बिना सीटू में फ्लोरोसेंटली दाग और छवि बनाने की क्षमता, और 3) तथ्य यह है कि झिल्ली कॉन्फोकल ‘स्लाइस’ की तुलना में पतली होती है ताकि प्रत्यक्ष सह-संस्कृतियों में सेल प्रकारों के बीच अधिक प्राकृतिक अंतर हो जो 6-10 μm-मोटी ट्रैक-अंकित झिल्ली के साथ प्राप्त किया जा सकता है।
हाल ही में, हमने तेजी से असेंबली34 और अनुकूलन 35,36 की सुविधा के लिए मंच को मॉड्यूलर प्रारूप में उन्नत किया। हमने अपने बायोइंजीनियरिंग और सहयोगी मस्तिष्क बाधा प्रयोगशालाओं के बीच डिवाइस घटकों को वितरित करने के लिए मॉड्यूलर प्रारूप का लाभ उठाया। फिर हमने संयुक्त रूप से डिवाइस असेंबली, मोनोकल्चर और सह-संस्कृति, इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला, और छोटे अणु पारगम्यता के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए और दिखाया कि ये विधियां प्रयोगशालाओं के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थीं। इन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने यह भी दिखाया कि मॉड्यूलर प्लेटफॉर्म मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) 37 से मस्तिष्क माइक्रोवास्कुलर जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीएमईसी) बनाने के लिए विस्तारित एंडोथेलियल कल्चर विधि (ईईसीएम) का उपयोग करके विकसित एक मान्य बीबीबी का समर्थन करता है। वर्तमान रिपोर्ट का उद्देश्य इन विधियों की अधिक विस्तार से समीक्षा करना है और साथ के वीडियो की सहायता से, बीबीबी समुदाय में मंच को व्यापक रूप से अपनाने की सुविधा प्रदान करना है।
जबकि झिल्ली चिप्स को स्थिरता के लिए डिज़ाइन किया गया है, वे असेंबली के दौरान गलत तरीके से संभालने पर क्रैक या टूट सकते हैं। इस प्रकार, चिप चिमटी में चिप को पकड़ना और धीरे से इसे फिक्स्चर में रखना महत्वपूर्ण है। सामान्य रूप से उपकरणों को संभालते समय, उपकरणों को टक्कर या गिराने के लिए अतिरिक्त सावधानी नहीं बरतनी चाहिए। झिल्ली चिप के फिक्स्चर ए 1 से संबंध के दौरान, चिप को सपाट रखा जाना चाहिए और घटक 1 के संबंध के दौरान झिल्ली दरार से बचने के लिए फिक्स्चर ए 1 के स्तंभ पर केंद्रित होना चाहिए। इसके अलावा, सुरक्षात्मक मास्क हटाने के बाद उजागर पीएसए परतों के साथ किसी भी संपर्क से बचना चाहिए। सुरक्षात्मक मास्क को हटाने के बाद घटक 2 को संभालते समय, इसे घटक के किनारे के साथ पकड़ने की सलाह दी जाती है और पीएसए-मुक्त त्रिकोण कोने को पकड़ने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
जबकि सेल कल्चर प्रोटोकॉल को संभावित बीबीबी मॉडल के लिए वर्णित किया गया था, यहां वर्णित बीबीबी का बीएमईसी / पेरिसिलेट सह-संस्कृति मॉडल शारीरिक संदर्भ और रुचि के सवालों के आधार पर पर्याप्त या अपर्याप्त हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी बड़े पैमाने पर मस्तिष्क के पोस्टकेशिका शिराओं में होती है41,42. इन क्षेत्रों में, एक पेरिवास्कुलर स्पेस एस्ट्रोसाइट्स द्वारा स्थापित ग्लियल लिमिटन्स से बीएमईसी / पेरिसिटेट बाधा को अलग करता है। इस प्रकार, पोस्टकेशिका शिराओं में, न्यूरोवास्कुलर यूनिट (एनवीयू) में श्रृंखला में दो शारीरिक रूप से अलग बाधाएं शामिल हैं, और एस्ट्रोसाइटिक एंड-फीट सीधे बीएमईसी / पेरिसिलेट रक्त बाधा से संपर्क नहीं करते हैं, जिसे वर्तमान मॉडल द्वारा अच्छी तरह से दर्शाया गया है। यदि लक्ष्य एक एनवीयू मॉडल है जो रक्त बाधा पर एस्ट्रोसाइट-स्रावित कारकों के प्रभाव के लिए जिम्मेदार है, तो डिवाइस में एक एस्ट्रोसाइट कम्पार्टमेंट जोड़ा जा सकता है जो पेरिवास्कुलर स्पेस के माध्यम से घुलनशील कारक विनिमय की अनुमति देता है। इस उदाहरण को पहले34 चित्रित किया गया था और इसे 3 डी ‘मस्तिष्क’ डिब्बे में माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स जैसे अन्य कोशिकाओं को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। प्लेटफ़ॉर्म का मॉड्यूलर आर्किटेक्चर इन पुनर्संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए सरल असेंबली रणनीतियों का उपयोग करने में सक्षम बनाता है ताकि प्लेटफ़ॉर्म हाथ में परिकल्पनाओं को संबोधित करने के लिए आवश्यक रूप से सरल या जटिल हो। प्रत्येक सेल संस्कृति सेटअप; हालांकि, नई सेल लाइनों और बहु-संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, सिलिकॉन-नाइट्राइड झिल्ली के गुणों के कारण, ऊतक संस्कृति प्लेटों की तुलना में कोटिंग समाधान को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। फाइब्रोनेक्टिन का समावेश आमतौर पर सेल लगाव और अस्तित्व में सहायता करता है। इसके अलावा, उपयोगकर्ता एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट्स को विपरीत दिशाओं में कल्चर कर सकते हैं। इस मामले में, उदाहरण के लिए, पारगम्यता माप बनाने और व्याख्या करने के तरीके को संशोधित करना आवश्यक हो सकता है। हालांकि, इस प्रकार की संस्कृति के लिए कदम प्रदान करना इस पेपर के दायरे से परे है।
सेल कल्चर के दौरान एक और चुनौती मीडिया का त्वरित वाष्पीकरण हो सकता है क्योंकि डिवाइस मानक ऊतक संस्कृति प्लेटों और फ्लास्क की तुलना में पर्यावरण में परिवर्तन के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकते हैं। यदि अतिरिक्त वाष्पीकरण देखा जाता है या सेल की वृद्धि धीमी हो जाती है, तो सटीक सेटिंग्स सुनिश्चित करने के लिए सभी महत्वपूर्ण इनक्यूबेटर मापदंडों को मापा जाना चाहिए। सेल कल्चर चैंबर के अंदर रखे गए ऊतक टोपी या छोटे पेट्री डिश में अधिक पानी जोड़ा जा सकता है, या मीडिया का अधिक बार आदान-प्रदान किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बुलबुले नीचे चैनल में प्रवेश कर सकते हैं और ट्रेंच-डाउन उपकरणों के लिए खाई में फंस सकते हैं। जबकि उन्हें हटाया जा सकता है, पहली जगह में बुलबुले जोड़ने से बचना सबसे आसान है। ऐसा करने के लिए, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि नीचे के कक्ष में मीडिया को पाइप करने से पहले पिपेट टिप या पिपेट टिप के अंत में हवा में कोई बुलबुले नहीं हैं। इसके अलावा, चैनल में मीडिया वाष्पीकरण से मीडिया की सतह और पोर्ट टॉप के बीच अंतर हो सकता है। मीडिया की एक छोटी मात्रा को एक बंदरगाह में पाइप किया जा सकता है जब तक कि मीडिया विपरीत बंदरगाह की सतह तक नहीं पहुंच जाता है, जिसके बाद मीडिया को उस विपरीत बंदरगाह में आदान-प्रदान किया जा सकता है। जबकि एचईसीएसआर और ई 6 + 10% एफबीएस मीडिया को पानी के स्नान में गर्म नहीं किया जाना चाहिए, बुलबुले के गठन को कम करने के लिए अन्य मीडिया को गर्म किया जा सकता है। यदि एक बुलबुला नीचे कक्ष में जाता है, तो इसे चैनल के माध्यम से 100 μL को जल्दी से पाइप करके हटाया जा सकता है। हालांकि, यह विधि डिवाइस की सतह पर फैले कक्षों या मीडिया के बीच संदूषण का कारण बन सकती है। यह सेल परतों को भी बाधित कर सकता है। वैकल्पिक रूप से, मीडिया को पहले चैनल से हटाया जा सकता है और फिर 50 μL वॉल्यूम के साथ फिर से पेश किया जा सकता है। हालांकि, पहले मीडिया को हटाने से चैनल में अधिक बुलबुला बन सकता है। यदि एक बुलबुला सीधे झिल्ली क्षेत्र के नीचे नहीं है, तो इसे सेल संस्कृति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ने के साथ चैनल में छोड़ा जा सकता है।
पेरिसिलेट लगाव और विकास, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, चुनौतीपूर्ण हो सकता है। शारीरिक रूप से प्रासंगिक पेरिसिलेट-टू-एंडोथेलियल सेल अनुपात के साथ एक परत के गठन के लिए एक अनुकूलित सीडिंग घनत्व का उपयोग करना आवश्यक है। इसके अलावा, चूंकि पेरिसाइट्स कतरनी के प्रति संवेदनशील होते हैं, इसलिए कोशिकाओं की रक्षा के लिए चैनल में सभी मीडिया आदान-प्रदान बहुत धीरे-धीरे किए जाने चाहिए। बीपीएलसी संस्कृति के लिए, 800 μg / mL कोलेजन प्रकार IV या 100 μg / mL फाइब्रोनेक्टिन के साथ निचले कक्ष को कोटिंग करके बेहतर लगाव प्राप्त किया जा सकता है।
यहां वर्णित उपकरणों में इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री सेल स्वास्थ्य और कार्य के गुणात्मक विश्लेषण को सक्षम बनाता है। ऊतक संवर्धन प्लेटों या अन्य प्लेटफार्मों में धुंधला होने के तरीकों को सीधे मंच में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। केवल शीर्ष कक्ष में सेल संस्कृति के लिए, निर्धारण के बाद, पीबीएस को नीचे के कक्ष में जोड़ा जा सकता है और शेष चरणों के लिए छोड़ दिया जा सकता है, जिसमें ब्लॉकिंग और धुंधला केवल शीर्ष कक्ष में किया जाता है। यह झिल्ली को तोड़ने या निचले कक्ष में बुलबुले प्राप्त करने के जोखिम को कम करता है। सह-संस्कृति धुंधला करने के लिए, हम सभी चरणों में दोनों कक्षों का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फिक्सेटिव और पीबीएस की चिपचिपाहट मीडिया से अलग है। इस प्रकार, निचले कक्ष में बुलबुले जोड़ना आसान हो सकता है, और नीचे के कक्ष में पाइपिंग से पहले टिप के अंत में हवा के लिए पिपेट युक्तियों की जांच करने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए।
छोटे अणु पारगम्यता परख के लिए वर्णित प्रोटोकॉल μSiM डिवाइस में सुसंस्कृत एंडोथेलियल कोशिकाओं के बाधा समारोह के कार्यात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस परख के दौरान आने वाली एक समस्या प्रोटोकॉल चरण 4.1.7.4 पर नीचे चैनल से नमूना संग्रह के दौरान पिपेट में हवा के बुलबुले खींच रही है। इस समस्या से बचने के लिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि नमूना संग्रह शुरू करने से पहले टिप को पोर्ट में सील कर दिया गया है और नमूना बहुत तेजी से नहीं खींचा जाना चाहिए। यदि यह समस्या को हल नहीं करता है, तो उपयोग की जाने वाली युक्तियों का आकार बंदरगाहों में फिट होने के लिए बहुत छोटा या बहुत बड़ा हो सकता है; सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध युक्तियों का उपयोग करें। यदि एक स्वस्थ दिखने वाले कंफ्लुएंट मोनोलेयर के बावजूद अप्रत्याशित रूप से उच्च पारगम्यता मूल्यों को मापा जाता है, तो नमूना संग्रह के दौरान व्यवधान के लिए मोनोलेयर की अखंडता की जांच की जानी चाहिए। हम हमेशा नमूना संग्रह के तुरंत बाद माइक्रोस्कोप के नीचे मोनोलेयर की जांच करने की सलाह देते हैं। यदि मोनोलेयर अभी भी बरकरार और स्वस्थ लगता है, तो नमूना तय किया जा सकता है और बाधा समारोह के जैविक मार्करों का मूल्यांकन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जंक्शन प्रोटीन के इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से। इसके विपरीत, यदि अप्रत्याशित रूप से कम पारगम्यता मूल्यों को मापा जाता है, तो यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि 50 μL मीडिया को बिना किसी हवा के बुलबुले के नीचे चैनल से नमूना लिया जाता है। यदि जलाशय की नोक रखते ही नमूना बंदरगाह से माध्यम बाहर आता है, तो पिपेट को सैंपलिंग पोर्ट में फिट करने से पहले उस मीडिया को एकत्र किया जाना चाहिए क्योंकि अधिकांश फ्लोरोसेंट छोटे अणु नीचे चैनल से नमूना किए गए प्रारंभिक 10 μL वॉल्यूम में मौजूद होंगे। हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके बंदरगाहों के चारों ओर सर्कल खींचना या बंदरगाह के चारों ओर एक छेद के साथ हाइड्रोफोबिक टेप रखना किसी भी निष्क्रिय रूप से पंप किए गए मीडिया को फैलने से रोकता है। यदि नमूने के दौरान बुलबुले वापस ले लिए जाते हैं या पूर्ण 50 μL नमूना नहीं हटाया जाता है, तो नमूने का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, सटीक मात्रा निर्धारित की जा सकती है और पारगम्यता गणना में उपयोग की जा सकती है; हालाँकि, यह केवल तभी किया जाना चाहिए जब हटाया गया वॉल्यूम ≥40 μL हो, जो ~ 98-99% डाई रिकवरी34 से मेल खाता है।
The authors have nothing to disclose.
जे.एल.एम., बी.ई., टी.आर.जी., एम.सी.एम., पी.के., एम.टी., के.सी., और एल.डब्ल्यू. को एनआईएच अनुदान आर 33 HL154249 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। J.L.M. को R44 GM137651 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एमएम को श्मिट प्रोग्राम अवार्ड डेल मोंटे इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोसाइंस, रोचेस्टर विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एमटी को आरएफ 1 AG079138 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। के.सी. को इंटरनेशनल फाउंडेशन फॉर एथिकल रिसर्च द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Antibodies | |||
CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
Experimental models: Cell lines | |||
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
Glassware and Plasticware | |||
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
Instruments | |||
10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
Other | |||
Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 – Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
Software | |||
Fiji | ImageJ | For image processing | |
Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |