Humant pseudoisletsystem til synkron vurdering af fluorescerende biosensordynamik og hormonsekretoriske profiler
Summary
Denne protokol beskriver en metode til synkron erhvervelse og medregistrering af intracellulære signalhændelser og udskillelse af insulin og glukagon af primære humane pseudoislets ved hjælp af adenoviral levering af en cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) biosensor, en cAMP-differensdetektor in situ (cADDis) og et mikroperifusionssystem.
Abstract
Langerhansøerne i bugspytkirtlen, som er små 3D-samlinger af specialiserede endokrine og understøttende celler spredt gennem bugspytkirtlen, har en central rolle i kontrollen af glukosehomeostase gennem udskillelse af insulin af betaceller, hvilket sænker blodsukkeret og glukagon af alfaceller, hvilket hæver blodsukkeret. Intracellulære signalveje, herunder dem, der medieres af cAMP, er nøglen til reguleret alfa- og betacellehormonsekretion. 3D-østrukturen, selvom den er afgørende for koordineret øfunktion, præsenterer eksperimentelle udfordringer for mekanistiske undersøgelser af de intracellulære signalveje i primære humane øceller. For at overvinde disse udfordringer og begrænsninger beskriver denne protokol en integreret levende cellebilleddannelse og mikrofluidisk platform ved hjælp af primære humane pseudoislets genereret fra donorer uden diabetes, der ligner indfødte øer i deres morfologi, sammensætning og funktion. Disse pseudoislets er størrelsesstyret gennem dispersions- og reaggregeringsprocessen af primære humane øceller. I dispergeret tilstand kan øcellegenekspression manipuleres; for eksempel kan biosensorer som den genetisk kodede cAMP-biosensor, cADDis, introduceres. Når pseudoislets, der udtrykker en genetisk kodet biosensor i kombination med konfokal mikroskopi og en mikroperifusionsplatform, giver mulighed for synkron vurdering af fluorescerende biosensordynamik og alfa- og betacellehormonsekretoriske profiler for at give mere indsigt i cellulære processer og funktion.
Introduction
Langerhansøerne er miniorganer spredt over hele bugspytkirtlen, hvis funktion er afgørende for opretholdelsen af glukosehomeostase. Insulin udskilles fra betaceller efter metabolismen af glucose, en stigning i ATP / ADP-forholdet, lukningen af ATP-følsomme kaliumkanaler, depolarisering af plasmamembranen og tilstrømningen af ekstracellulært calcium1. Glucagon sekretion fra alfaceller er mindre forstået, men det er blevet postuleret, at intracellulære og parakrin veje bidrager til glucagon granulat exocytose 2,3,4. Både type 1 og type 2 diabetes er forbundet med øcelledysfunktion 5,6,7. Derfor er belysning af de intracellulære signalveje, der medierer øhormonsekretion, afgørende for at forstå fysiologiske og patologiske mekanismer i bugspytkirteløer.
Den sfæriske arkitektur af holme præsenterer visse hindringer for eksperimentering. Disse udfordringer omfatter variationer i holmstørrelsen og 3D-karakteren af holme, hvilket reducerer viral transduktion inden for holmens kerne 8,9. For at overvinde disse udfordringer blev der udviklet et pseudoislet-system, hvor primære menneskelige øer spredes i enkeltceller, adenoviralt transduceret med konstruktioner, der koder for mål af interesse, og reaggregeres til dannelse af størrelseskontrollerede, ølignende strukturer kaldet pseudoislets7. Sammenlignet med indfødte øer fra samme donor, der er dyrket parallelt, er disse pseudoislets ens i morfologi, endokrin cellesammensætning og hormonsekretion7. Denne metode giver mulighed for ekspression af konstruktioner i hele pseudoislet, hvilket betyder, at den overvinder en tidligere barriere for ensartet genetisk manipulation af primære menneskelige øer 7,8,9.
I denne protokol er pseudoisletsystemet integreret med en mikrofluidisk enhed til at udtrykke biosensorer i primære humane øceller og opnå tidsmæssig opløsning af pseudoislethormonsekretion under dynamisk perifusion10,11,12. Pseudoisletterne placeres i en mikrochip og udsættes for en jævn strøm af forskellige sekretagoger via en peristaltisk pumpe12. Mikrochippen har en gennemsigtig glasbund og er monteret på et konfokalmikroskop for at registrere den intracellulære signaldynamik via ændringer i biosensorens fluorescensintensitet. Biosensorbilleddannelse synkroniseres med opsamling af mikroperifusionsspildevand til efterfølgende analyse af insulin og glukagonsekretion7. Sammenlignet med makroperifusion giver denne mikroperifusionsmetode mulighed for at anvende færre pseudoisletter på grund af det mindre volumen af den mikrofluidiske enhed sammenlignet med makroperifusionskammeret7.
For at udnytte nytten af dette system blev den cykliske adenosinmonophosphat (cAMP) differensdetektor in situ (cADDis) biosensor udtrykt i humane pseudoislets for at vurdere cAMP-dynamik og hormonsekretion. cADDis-biosensoren består af et cirkulært permuteret grønt fluorescerende protein (cpGFP) placeret i hængselområdet i et udvekslingsprotein aktiveret af cAMP 2 (EPAC2), der forbinder dets regulatoriske og katalytiske regioner. Bindingen af cAMP til EPAC2’s regulatoriske område fremkalder en konformationsændring i hængselområdet, der øger fluorescensen fra cpGFP13. Intracellulære budbringere såsom cAMP fremkalder insulin og glukagonsekretion efter opstrømsaktivering af G-proteinkoblede receptorer14. Levende cellebilleddannelse kombineret med mikroperifusion hjælper med at forbinde den intracellulære cAMP-dynamik med øhormonsekretion. Specifikt genereres cADDis-ekspressive pseudoislets i denne protokol for at overvåge cAMP-responser i alfa- og betaceller til forskellige stimuli: lav glukose (2 mM glucose; G 2), høj glucose plus isobutylmethylxanthin (IBMX; 20 mM glucose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) og lav glukose plus adrenalin (Epi; 2 mM glucose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Denne behandlingsarbejdsgang muliggør vurdering af den intracellulære cAMP-dynamik direkte via 1) IBMX-medieret phosphodiesterasehæmning, hvilket forbedrer intracellulære cAMP-niveauer ved at forhindre dets nedbrydning, og 2) adrenalin, en kendt cAMP-afhængig stimulator af alfacelleglukagonsekretion medieret af β-adrenerg receptoraktivering. Trinene til opsætning af mikroperifusionsapparatet til levende cellebilleddannelsesforsøg, indlæsning af pseudoislets i mikrochippen, synkron levende cellebilleddannelse og mikroperifusion og analyse af biosensorspor og hormonsekretion ved mikropladebaserede hormonassays er beskrevet nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Integrationen af et mikroperifusionssystem, biosensor-ekspressive pseudoislets og laser-scanning konfokal mikroskopi muliggør synkron vurdering af intracellulære signalhændelser og dynamiske hormonsekretoriske profiler. Det dynamiske mikroperifusionssystem kan levere en række veldefinerede stimuli til pseudoislets og giver mulighed for opsamling af spildevandet, hvor insulin- og glukagonkoncentrationerne kan måles ved hjælp af kommercielt tilgængelig ELISA. Samtidig fanger levende cellebilleddannelse af de biosens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Organdonorer og deres familier værdsættes for deres uvurderlige donationer, og International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) og National Disease Research Exchange (NDRI) anerkendes for deres partnerskab med at gøre humant bugspytkirtelvæv tilgængeligt for forskning. Dette arbejde blev støttet af Human Islet Research Network (RRID: SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program (RRID: SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 og DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. og Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, US Department of Veterans Affairs (BX000666), NIGMS fra National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 og National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
