Menselijk pseudo-eilandsysteem voor synchrone beoordeling van fluorescerende biosensordynamica en hormoonsecretoire profielen
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de synchrone acquisitie en co-registratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en de secretie van insuline en glucagon door primaire menselijke pseudo-eilandjes met behulp van de adenovirale toediening van een cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) biosensor, een cAMP-verschildetector in situ (cADDis) en een microperifusiesysteem.
Abstract
De pancreaseilandjes van Langerhans, kleine 3D-verzamelingen van gespecialiseerde endocriene en ondersteunende cellen verspreid over de alvleesklier, spelen een centrale rol bij de controle van de glucosehomeostase door de afscheiding van insuline door bètacellen, die de bloedglucose verlaagt, en glucagon door alfacellen, die de bloedglucose verhoogt. Intracellulaire signaalroutes, inclusief die gemedieerd door cAMP, zijn essentieel voor gereguleerde secretie van alfa- en bètacelhormonen. De 3D-eilandjesstructuur, hoewel essentieel voor de gecoördineerde eilandjesfunctie, vormt experimentele uitdagingen voor mechanistische studies van de intracellulaire signaalroutes in primaire menselijke eilandjescellen. Om deze uitdagingen en beperkingen te overwinnen, beschrijft dit protocol een geïntegreerd beeldvormings- en microfluïdisch platform voor levende cellen met behulp van primaire menselijke pseudo-eilandjes die zijn gegenereerd door donoren zonder diabetes die qua morfologie, samenstelling en functie lijken op inheemse eilandjes. Deze pseudo-eilandjes worden op grootte gecontroleerd door het dispersie- en reaggregatieproces van primaire menselijke eilandjescellen. In de gedispergeerde toestand kan de genexpressie van eilandjescellen worden gemanipuleerd; zo kunnen biosensoren zoals de genetisch gecodeerde cAMP-biosensor, cADDis, worden geïntroduceerd. Eenmaal gevormd, maken pseudo-eilandjes die een genetisch gecodeerde biosensor tot expressie brengen, in combinatie met confocale microscopie en een microperifusieplatform, de synchrone beoordeling mogelijk van fluorescerende biosensordynamiek en alfa- en bètacelhormoonsecretoire profielen om meer inzicht te geven in cellulaire processen en functie.
Introduction
De eilandjes van Langerhans zijn mini-organen verspreid over de alvleesklier waarvan de functie cruciaal is voor het behoud van de glucosehomeostase. Insuline wordt uitgescheiden door bètacellen na het metabolisme van glucose, een toename van de ATP/ADP-verhouding, de sluiting van ATP-gevoelige kaliumkanalen, depolarisatie van het plasmamembraan en de instroom van extracellulair calcium1. De glucagonsecretie van alfacellen wordt minder begrepen, maar er is gepostuleerd dat intracellulaire en paracriene routes bijdragen aan de exocytose van glucagonkorrels 2,3,4. Zowel diabetes type 1 als type 2 worden in verband gebracht met disfunctie van eilandjescellen 5,6,7. Daarom is het ophelderen van de intracellulaire signaalroutes die de secretie van eilandjeshormoon mediëren essentieel voor het begrijpen van fysiologische en pathologische mechanismen in pancreaseilandjes.
De bolvormige architectuur van eilandjes vormt een aantal obstakels voor experimenten. Deze uitdagingen omvatten variatie in de grootte van eilandjes en de 3D-aard van eilandjes, waardoor de virale transductie in de eilandjeskern wordt verminderd 8,9. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, werd een pseudo-eilandjessysteem ontwikkeld, waarbij primaire menselijke eilandjes worden verspreid in afzonderlijke cellen, adenoviaal worden getransduceerd met constructies die coderen voor doelen van belang, en opnieuw worden samengevoegd om groottegecontroleerde, eilandjesachtige structuren te vormen die pseudo-eilandjes worden genoemd7. Vergeleken met inheemse eilandjes van dezelfde donor die parallel zijn gekweekt, zijn deze pseudo-eilandjes vergelijkbaar in morfologie, endocriene celsamenstelling en hormoonsecretie7. Deze methode maakt het mogelijk om constructen in het hele pseudo-eilandje tot expressie te brengen, wat betekent dat het een eerdere barrière voor de uniforme genetische manipulatie van primaire menselijke eilandjes overwint 7,8,9.
In dit protocol is het pseudo-eilandjessysteem geïntegreerd met een microfluïdisch apparaat om biosensoren tot expressie te brengen in primaire menselijke eilandjescellen en om temporele resolutie van pseudo-eilandhormoonsecretie te verkrijgen tijdens dynamische perifusie10,11,12. De pseudo-eilandjes worden in een microchip geplaatst en via een peristaltische pomp blootgesteld aan een gestage stroom van verschillende secretagogen12. De microchip heeft een transparante glazen bodem en is gemonteerd op een confocale microscoop om de intracellulaire signaaldynamiek vast te leggen via veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van de biosensor. Biosensorbeeldvorming wordt gesynchroniseerd met de verzameling van microperifusie-effluent voor de daaropvolgende analyse van insuline- en glucagonsecretie7. In vergelijking met macroperifusie maakt deze microperifusiebenadering het mogelijk om minder pseudobeitels te gebruiken vanwege het kleinere volume van het microfluïdische apparaat in vergelijking met de macroperifusiekamer7.
Om het nut van dit systeem te benutten, werd de cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) verschildetector in situ (cADDis) biosensor tot expressie gebracht in menselijke pseudobeitlets om de cAMP-dynamiek en hormoonsecretie te beoordelen. De cADDis-biosensor is samengesteld uit een circulair gepermuteerd groen fluorescerend eiwit (cpGFP) dat zich in het scharniergebied bevindt van een uitwisselingseiwit dat wordt geactiveerd door cAMP 2 (EPAC2), dat de regulerende en katalytische regio’s met elkaar verbindt. De binding van cAMP aan het regulerende gebied van EPAC2 veroorzaakt een conformatieverandering in het scharniergebied die de fluorescentie van het cpGFP13 verhoogt. Intracellulaire boodschappers zoals cAMP wekken insuline- en glucagonsecretie op na de stroomopwaartse activering van G-proteïne gekoppelde receptoren14. Beeldvorming van levende cellen in combinatie met microperifusie helpt de intracellulaire cAMP-dynamiek te verbinden met de secretie van eilandjeshormonen. In het bijzonder worden in dit protocol cADDis-expressieve pseudo-eilandjes gegenereerd om cAMP-responsen in alfa- en bètacellen op verschillende stimuli te volgen: lage glucose (2 mM glucose; G 2), hoge glucose plus isobutylmethylxanthine (IBMX; 20 mM glucose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX), en lage glucose plus epinefrine (Epi; 2 mM glucose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Deze behandelingsworkflow maakt de beoordeling van de intracellulaire cAMP-dynamiek rechtstreeks mogelijk via 1) IBMX-gemedieerde fosfodiësterase-remming, die de intracellulaire cAMP-niveaus verhoogt door de afbraak ervan te voorkomen, en 2) epinefrine, een bekende cAMP-afhankelijke stimulator van alfacelglucagonsecretie gemedieerd door activering van β-adrenerge receptoren. De stappen voor het opzetten van het microperifusieapparaat voor beeldvormingsexperimenten met levende cellen, het laden van de pseudo-eilandjes in de microchip, synchrone beeldvorming van levende cellen en microperifusie, en de analyse van de biosensorsporen en hormoonsecretie door middel van hormoonassays op basis van microplaten worden hieronder beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
De integratie van een microperifusiesysteem, pseudobeitels die biosensor tot expressie brengen en confocale microscopie met laserscanning maakt de synchrone beoordeling van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en dynamische hormoonsecretoire profielen mogelijk. Het dynamische microperifusiesysteem kan een reeks welbepaalde stimuli aan de pseudobeitjes leveren en maakt het mogelijk om het effluent op te vangen, waarbij de insuline- en glucagonconcentraties kunnen worden gemeten door de in de handel verkrijgbare ELIS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Orgaandonoren en hun families worden gewaardeerd voor hun onschatbare donaties, en het International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) en de National Disease Research Exchange (NDRI) worden erkend voor hun samenwerking bij het toegankelijk maken van menselijk alvleesklierweefsel voor onderzoek. Dit werk werd ondersteund door het Human Islet Research Network (RRID:SCR_014393), het Human Pancreas Analysis Program (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 en DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), The Leona M. en Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, het Amerikaanse ministerie van Veteranenzaken (BX000666), de NIGMS van de National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830, en de National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
