Système de pseudo-îlots humains pour l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion hormonale
Summary
Ce protocole décrit une méthode d’acquisition synchrone et de co-enregistrement d’événements de signalisation intracellulaire et de sécrétion d’insuline et de glucagon par des pseudo-îlots humains primaires en utilisant l’administration adénovirale d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), d’un détecteur de différence d’AMPc in situ (cADDis) et d’un système de micropérifusion.
Abstract
Les îlots pancréatiques de Langerhans, qui sont de petites collections 3D de cellules endocriniennes et de soutien spécialisées disséminées dans tout le pancréas, jouent un rôle central dans le contrôle de l’homéostasie du glucose par la sécrétion d’insuline par les cellules bêta, ce qui abaisse la glycémie, et de glucagon par les cellules alpha, qui augmente la glycémie. Les voies de signalisation intracellulaires, y compris celles médiées par l’AMPc, sont essentielles à la sécrétion régulée d’hormones alpha et bêta des cellules. La structure 3D des îlots pancréatiques, bien qu’essentielle à la coordination de la fonction des îlots pancréatiques, présente des défis expérimentaux pour les études mécanistiques des voies de signalisation intracellulaires dans les cellules primaires des îlots pancréatiques humains. Pour surmonter ces défis et ces limitations, ce protocole décrit une plate-forme intégrée d’imagerie et de microfluidique de cellules vivantes utilisant des pseudo-îlots humains primaires générés à partir de donneurs non diabétiques qui ressemblent à des îlots natifs dans leur morphologie, leur composition et leur fonction. La taille de ces pseudo-îlots est contrôlée par le processus de dispersion et de réagrégation des cellules primaires des îlots pancréatiques humains. À l’état dispersé, l’expression des gènes des cellules des îlots pancréatiques peut être manipulée ; par exemple, des biocapteurs tels que le biocapteur d’AMPc génétiquement codé, cADDis, peuvent être introduits. Une fois formés, les pseudo-îlots exprimant un biocapteur génétiquement codé, en combinaison avec la microscopie confocale et une plateforme de micropérifusion, permettent l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion des hormones alpha et bêta des cellules alpha et bêta afin de mieux comprendre les processus et la fonction cellulaires.
Introduction
Les îlots de Langerhans sont des mini-organes disséminés dans tout le pancréas dont la fonction est cruciale pour le maintien de l’homéostasie du glucose. L’insuline est sécrétée par les cellules bêta à la suite du métabolisme du glucose, d’une augmentation du rapport ATP/ADP, de la fermeture des canaux potassiques sensibles à l’ATP, d’une dépolarisation de la membrane plasmique et de l’afflux de calcium extracellulaire1. La sécrétion de glucagon par les cellules alpha est moins comprise, mais il a été postulé que les voies intracellulaires et paracrines contribuent à l’exocytose des granules de glucagon 2,3,4. Le diabète de type 1 et le diabète de type 2 sont associés à un dysfonctionnement des cellules des îlots pancréatiques 5,6,7. Par conséquent, l’élucidation des voies de signalisation intracellulaires médiant la sécrétion d’hormones des îlots pancréatiques est essentielle pour comprendre les mécanismes physiologiques et pathologiques des îlots pancréatiques.
L’architecture sphérique des îlots présente certains obstacles à l’expérimentation. Ces défis comprennent la variation de la taille des îlots et la nature 3D des îlots, ce qui réduit la transduction virale dans le noyau des îlots 8,9. Pour surmonter ces défis, un système de pseudo-îlots a été développé, dans lequel les îlots humains primaires sont dispersés en cellules uniques, transduits adénovialement avec des constructions codant pour des cibles d’intérêt, et réagrégés pour former des structures ressemblant à des îlots de taille contrôlée appelées pseudo-îlots7. Comparés aux îlots natifs du même donneur qui ont été cultivés en parallèle, ces pseudo-îlots sont similaires en termes de morphologie, de composition des cellules endocrines et de sécrétion d’hormones7. Cette méthode permet l’expression de constructions dans tout le pseudo-îlot, ce qui signifie qu’elle surmonte un obstacle antérieur à la manipulation génétique uniforme des îlots humains primaires 7,8,9.
Dans ce protocole, le système de pseudo-îlots pancréatiques est intégré à un dispositif microfluidique pour exprimer des biocapteurs dans les cellules primaires des îlots pancréatiques humains et obtenir une résolution temporelle de la sécrétion d’hormone pseudo-îlots au cours de la périfusion dynamique10,11,12. Les pseudo-îlots sont placés dans une micropuce et exposés à un flux constant de différents sécrétagogues via une pompe péristaltique12. La micropuce a un fond en verre transparent et est montée sur un microscope confocal pour enregistrer la dynamique de signalisation intracellulaire via les changements d’intensité de fluorescence du biocapteur. L’imagerie par biocapteur est synchronisée avec le prélèvement d’effluents de micropérifusion pour l’analyse ultérieure de la sécrétion d’insuline et de glucagon7. Par rapport à la macropérifusion, cette approche de micropérifusion permet d’utiliser moins de pseudo-îlots en raison du volume plus petit du dispositif microfluidique par rapport à la chambre de macropérifusion7.
Pour exploiter l’utilité de ce système, le biocapteur cyclique de détection de différence d’adénosine monophosphate (AMPc) in situ (cADDis) a été exprimé dans des pseudo-îlots humains afin d’évaluer la dynamique de l’AMPc et la sécrétion d’hormones. Le biocapteur cADDis est composé d’une protéine fluorescente verte permutée circulairement (cpGFP) positionnée dans la région charnière d’une protéine d’échange activée par l’AMPc 2 (EPAC2), reliant ses régions régulatrices et catalytiques. La liaison de l’AMPc à la région régulatrice de l’EPAC2 provoque un changement conformationnel dans la région de la charnière qui augmente la fluorescence du cpGFP13. Les messagers intracellulaires tels que l’AMPc provoquent la sécrétion d’insuline et de glucagon après l’activation en amont des récepteurs couplés aux protéines G14. L’imagerie de cellules vivantes couplée à la micropérifusion permet de relier la dynamique de l’AMPc intracellulaire à la sécrétion d’hormones des îlots pancréatiques. Plus précisément, dans ce protocole, des pseudo-îlots exprimant cADDis sont générés pour surveiller les réponses de l’AMPc dans les cellules alpha et bêta à divers stimuli : faible taux de glucose (2 mM de glucose ; G 2), hyperglycémie et isobutylméthylxanthine (IBMX ; 20 mM de glucose + 100 μM IBMX ; G 20 + IBMX) et un faible taux de glucose et d’épinéphrine (Epi ; 2 mM de glucose + 1 μM Epi ; G 2 + Epi). Ce flux de travail de traitement permet d’évaluer la dynamique de l’AMPc intracellulaire directement via 1) l’inhibition de la phosphodiestérase médiée par IBMX, qui améliore les niveaux d’AMPc intracellulaire en empêchant sa dégradation, et 2) l’épinéphrine, un stimulateur connu de l’AMPc dépendant de la sécrétion de glucagon des cellules alpha médié par l’activation du récepteur β-adrénergique. Les étapes de mise en place de l’appareil de micropérifusion pour les expériences d’imagerie de cellules vivantes, le chargement des pseudo-îlots dans la micropuce, l’imagerie synchrone des cellules vivantes et la micropérifusion, ainsi que l’analyse des traces de biocapteurs et de la sécrétion hormonale par des dosages hormonaux sur microplaque sont détaillées ci-dessous.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’intégration d’un système de micropérifusion, de pseudo-îlots exprimant des biocapteurs et d’une microscopie confocale à balayage laser permet l’évaluation synchrone des événements de signalisation intracellulaire et des profils dynamiques de sécrétion hormonale. Le système de micropérifusion dynamique peut fournir une série de stimuli bien définis aux pseudo-îlots et permet la collecte de l’effluent, dans laquelle les concentrations d’insuline et de glucagon peuvent être mesurées par ELISA …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les donneurs d’organes et leurs familles sont appréciés pour leurs dons inestimables, et l’Institut international des organisations d’approvisionnement en organes, l’Advancement of Medicine (IIAM) et le National Disease Research Exchange (NDRI) sont reconnus pour leur partenariat visant à rendre le tissu pancréatique humain accessible à la recherche. Ces travaux ont été soutenus par le Réseau de recherche sur les îlots humains (RRID :SCR_014393), le Programme d’analyse du pancréas humain (RRID :SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 et DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), le Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, FRDJ, le département des Anciens Combattants des États-Unis (BX000666), le NIGMS des National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 et la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
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