מערכת פסאודואיסלט אנושית להערכה סינכרונית של דינמיקה ביו-חיישנית פלואורסצנטית ופרופילי הפרשת הורמונים
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה סינכרונית ורישום משותף של אירועי איתות תוך תאיים והפרשת אינסולין וגלוקגון על ידי פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים באמצעות העברה אדנו-ויראלית של ביו-סנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP), גלאי הפרשי cAMP באתרו (cADDis) ומערכת מיקרופריפיוזיה.
Abstract
איי הלבלב של לנגרהנס, שהם אוספים תלת-ממדיים קטנים של תאים אנדוקריניים ותומכים מיוחדים הפזורים ברחבי הלבלב, הם בעלי תפקיד מרכזי בשליטה על הומאוסטזיס גלוקוז באמצעות הפרשת אינסולין על ידי תאי בטא, אשר מוריד את רמת הגלוקוז בדם, וגלוקגון על ידי תאי אלפא, אשר מעלה את רמת הגלוקוז בדם. מסלולי איתות תוך-תאיים, כולל אלה המתווכים על-ידי cAMP, חיוניים להפרשת הורמוני אלפא ובטא מוסדרים. מבנה האיון התלת-ממדי, אף שהוא חיוני לתפקוד מתואם של האיונים, מציב אתגרים ניסיוניים למחקרים מכניסטיים של מסלולי האיתות התוך-תאיים בתאי איון אנושיים ראשוניים. כדי להתגבר על אתגרים ומגבלות אלה, פרוטוקול זה מתאר דימות משולב של תאים חיים ופלטפורמה מיקרופלואידית באמצעות פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים שנוצרו מתורמים ללא סוכרת הדומים לאיונים מקומיים במורפולוגיה, בהרכב ובתפקוד שלהם. פסאודואיסטים אלה נשלטים בגודל באמצעות תהליך הפיזור והצבירה מחדש של תאי איון אנושיים ראשוניים. במצב המפוזר, ביטוי גנים של תאי איון יכול להיות מניפולציה; לדוגמה, ניתן להציג ביו-חיישנים כגון cAMP biosensor המקודד גנטית, cADDis. לאחר היווצרותם, פסאודואיסטים המבטאים ביו-סנסור מקודד גנטית, בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי ופלטפורמת מיקרופריפוזיה, מאפשרים הערכה סינכרונית של דינמיקה של ביו-חיישנים פלואורסצנטיים ופרופילי הפרשת הורמוני אלפא ובטא כדי לספק תובנה רבה יותר לגבי תהליכים ותפקוד תאיים.
Introduction
האיים של לנגרהנס הם מיני איברים המפוזרים ברחבי הלבלב שתפקידם חיוני לשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז. אינסולין מופרש מתאי בטא בעקבות חילוף חומרים של גלוקוז, עלייה ביחס ATP/ADP, סגירת תעלות אשלגן רגישות ל-ATP, דפולריזציה של קרום הפלזמה וזרימה של סידן1 חוץ-תאי. הפרשת גלוקגון מתאי אלפא מובנת פחות, אך הועלתה השערה כי מסלולים תוך-תאיים ופרקריניים תורמים לאקסוציטוזה של גרגרי גלוקגון 2,3,4. הן סוכרת מסוג 1 והן סוכרת מסוג 2 קשורות לתפקוד לקוי של תאי איון 5,6,7. לכן, הבהרת מסלולי האיתות התוך-תאיים המתווכים את הפרשת הורמון האיון חיונית להבנת מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים באיי הלבלב.
הארכיטקטורה הכדורית של איים מציגה מכשולים מסוימים לניסויים. אתגרים אלה כוללים את השונות בגודל האיון ואת הטבע התלת-ממדי של האיונים, אשר מפחית את התמרה נגיפית בתוך ליבת האיון 8,9. כדי להתגבר על אתגרים אלה, פותחה מערכת פסאודואיסלט, שבה איים אנושיים ראשוניים מפוזרים לתאים בודדים, מומרים אדנו-ויראליות עם מבנים המקודדים מטרות מעניינות, ומצטברים מחדש ליצירת מבנים דמויי איונים מבוקרי גודל המכונים פסאודו-איונים7. בהשוואה לאיים מקומיים מאותו תורם שגודלו בתרבית במקביל, פסאודואיסטים אלה דומים במורפולוגיה, בהרכב התאים האנדוקריניים ובהפרשת הורמונים7. שיטה זו מאפשרת ביטוי של מבנים ברחבי הפסאודואיון, כלומר היא מתגברת על מחסום קודם למניפולציה גנטית אחידה של איים אנושיים ראשוניים 7,8,9.
בפרוטוקול זה, מערכת הפסאודואיסלט משולבת עם מכשיר מיקרופלואידי כדי לבטא ביוסנסורים בתאי איון אנושיים ראשוניים ולקבל רזולוציה זמנית של הפרשת הורמון פסאודואיסלט במהלך פריפוזיה דינמית10,11,12. הפסאודואיסטים מונחים בתוך שבב ונחשפים לזרימה קבועה של סודות שונים באמצעות משאבה פריסטלטית12. לשבב יש תחתית זכוכית שקופה והוא מורכב על מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להקליט את דינמיקת האיתות התוך תאי באמצעות שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של הביו-סנסור. הדמיה Biosensor מסונכרן עם אוסף של שפכי microperifusion לניתוח הבא של אינסולין הפרשת גלוקגון7. בהשוואה למקרופריפוזיה, גישת מיקרופריפיוז’ן זו מאפשרת שימוש בפחות פסאודואיסטים בשל הנפח הקטן יותר של המכשיר המיקרופלואידי בהשוואה לתא המקרופריפיוז’ן7.
כדי לרתום את התועלת של מערכת זו, הביוסנסור המחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP) מתבטא בפסאודואיסטים אנושיים כדי להעריך דינמיקה של cAMP והפרשת הורמונים. הביוסנסור cADDis מורכב מחלבון פלואורסצנטי ירוק בעל תמורות מעגליות (cpGFP) הממוקם באזור הציר של חלבון חליפין המופעל על ידי cAMP 2 (EPAC2), ומחבר בין אזורי הבקרה והקטליטים שלו. הקישור של cAMP לאזור הרגולציה של EPAC2 מעורר שינוי קונפורמטיבי באזור הציר שמגביר את הפלואורסצנטיות מה-cpGFP13. שליחים תוך-תאיים כגון cAMP מעוררים הפרשת אינסולין וגלוקגון לאחר הפעלה במעלה הזרם של קולטנים מצומדים לחלבון G14. הדמיה של תאים חיים בשילוב עם מיקרופריפוזיה מסייעת לחבר את דינמיקת cAMP תוך תאית עם הפרשת הורמון איון. באופן ספציפי, בפרוטוקול זה, פסאודואיסטים המבטאים cADDis נוצרים כדי לנטר תגובות cAMP בתאי אלפא ובטא לגירויים שונים: גלוקוז נמוך (2 מילימטר גלוקוז; G 2), גלוקוז גבוה בתוספת איזובוטילמתילקסנטין (IBMX; 20 מ”מ גלוקוז + 100 מיקרומטר IBMX; G 20 + IBMX), וגלוקוז נמוך בתוספת אפינפרין (Epi; 2 mM גלוקוז + 1 μM Epi; G 2 + Epi). זרימת עבודה טיפולית זו מאפשרת הערכה של דינמיקת cAMP תוך תאית ישירות באמצעות 1) עיכוב פוספודיאסטראז בתיווך IBMX, אשר משפר את רמות cAMP תוך תאי על ידי מניעת התפרקותו, ו -2) אפינפרין, ממריץ תלוי cAMP ידוע של הפרשת גלוקגון תאי אלפא בתיווך הפעלת קולטן β-אדרנרגי. השלבים להקמת מנגנון המיקרופריפיוז’ן לניסויי הדמיה של תאים חיים, טעינת הפסאודואיסטים לתוך השבב, דימות סינכרוני של תאים חיים ומיקרופריפוזיה, וניתוח עקבות הביו-חיישנים והפרשת הורמונים על ידי בדיקות הורמונים מבוססות מיקרו-צלחות מפורטים להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
השילוב של מערכת מיקרופריפוזיה, פסאודואיסטים המבטאים חיישנים ביולוגיים ומיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר מאפשר הערכה סינכרונית של אירועי איתות תוך תאיים ופרופילי הפרשת הורמונים דינמיים. מערכת המיקרופריפוזיה הדינמית יכולה לספק סדרה של גירויים מוגדרים היטב לפסאודואיסטים ומאפשרת איסוף קול?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תורמי איברים ובני משפחותיהם זוכים להערכה על תרומותיהם שלא יסולא בפז, והמכון הבינלאומי לארגונים לרכישת איברים, קידום הרפואה (IIAM) והבורסה הלאומית לחקר מחלות (NDRI) מוכרים על שותפותם בהנגשת רקמת הלבלב האנושית למחקר. עבודה זו נתמכה על ידי רשת המחקר של האי האנושי (RRID:SCR_014393), התוכנית לניתוח לבלב אנושי (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 ו-DK20593 (מרכז המחקר וההדרכה לסוכרת ונדרבילט), קרן הצדקה ע”ש ליאונה מ. והארי ב. הלמסלי, JDRF, המחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה”ב (BX000666), NIGMS של המכונים הלאומיים לבריאות (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830, ואת הקרן הלאומית למחקר בוגר מחקר (1937963).
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
