Humant pseudoisletsystem for synkron vurdering av fluorescerende biosensordynamikk og hormonsekretoriske profiler

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for synkron oppkjøp og samregistrering av intracellulære signalhendelser og utskillelse av insulin og glukagon ved primære humane pseudoisleter ved bruk av adenoviral levering av en syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) biosensor, en cAMP-differansedetektor in situ (cADDis) og et mikroperifusjonssystem.

Abstract

De pankreatiske øyene Langerhans, som er små 3D-samlinger av spesialiserte endokrine og støttende celler spredt over hele bukspyttkjertelen, har en sentral rolle i kontrollen av glukosehomeostase gjennom utskillelse av insulin av beta-celler, noe som senker blodsukkeret og glukagon av alfa-celler, noe som øker blodsukkeret. Intracellulære signalveier, inkludert de som medieres av cAMP, er nøkkelen til regulert alfa- og betacellehormonsekresjon. Selv om 3D-holmestrukturen er essensiell for koordinert holmefunksjon, presenterer den eksperimentelle utfordringer for mekanistiske studier av de intracellulære signalveiene i primære menneskelige øyceller. For å overvinne disse utfordringene og begrensningene, beskriver denne protokollen en integrert levende celleavbildning og mikrofluidisk plattform ved bruk av primære humane pseudoislets generert fra givere uten diabetes som ligner innfødte øyer i deres morfologi, sammensetning og funksjon. Disse pseudoislets er størrelseskontrollert gjennom dispersjons- og reaggregeringsprosessen av primære menneskelige øyceller. I dispergert tilstand kan øycellegenuttrykk manipuleres; for eksempel kan biosensorer som den genetisk kodede cAMP-biosensoren, cADDis, introduseres. Når de er dannet, tillater pseudoisleter som uttrykker en genetisk kodet biosensor, i kombinasjon med konfokal mikroskopi og en mikroperifusjonsplattform, synkron vurdering av fluorescerende biosensordynamikk og alfa- og betacellehormonsekretoriske profiler for å gi mer innsikt i cellulære prosesser og funksjon.

Introduction

De Langerhanske øyer er miniorganer spredt over hele bukspyttkjertelen, hvis funksjon er avgjørende for vedlikehold av glukosehomeostase. Insulin utskilles fra betaceller etter metabolismen av glukose, en økning i ATP / ADP-forholdet, lukningen av ATP-sensitive kaliumkanaler, depolarisering av plasmamembranen og tilstrømningen av ekstracellulært kalsium¹. Glukagon sekresjon fra alfa celler er mindre forstått, men det har blitt postulert at intracellulære og parakrine veier bidrar til glukagon granul eksocytose ^2,3,4. Både type 1 og type 2 diabetes er assosiert med øycelledysfunksjon ^5,6,7. Derfor er det viktig å belyse de intracellulære signalveiene som medierer øyhormonsekresjon for å forstå fysiologiske og patologiske mekanismer i bukspyttkjerteløyer.

Den sfæriske arkitekturen av holmer presenterer visse hindringer for eksperimentering. Disse utfordringene inkluderer variasjon i holmestørrelse og 3D-naturen til holmer, noe som reduserer viral transduksjon i holmekjernen ^8,9. For å overvinne disse utfordringene ble det utviklet et pseudoislet-system, hvor primære menneskelige øyer blir spredt i enkeltceller, adenoviralt transducert med konstruksjoner som koder for mål av interesse, og reaggregert for å danne størrelseskontrollerte, holmelignende strukturer kalt pseudoislets⁷. Sammenlignet med innfødte øyer fra samme donor som har blitt dyrket parallelt, er disse pseudoislets like i morfologi, endokrin cellesammensetning og hormonsekresjon⁷. Denne metoden tillater uttrykk for konstruksjoner gjennom pseudoiletten, noe som betyr at den overvinner en tidligere barriere for ensartet genetisk manipulering av primære menneskelige øyer ^7,8,9.

I denne protokollen er pseudoisletsystemet integrert med en mikrofluidisk enhet for å uttrykke biosensorer i primære menneskelige øyceller og få tidsmessig oppløsning av pseudoislet hormonsekresjon under dynamisk perifusjon^10,11,12. Pseudoislets er plassert i en mikrochip og utsatt for en jevn strøm av forskjellige sekretagoger via en peristaltisk pumpe¹². Mikrochippen har en gjennomsiktig glassbunn og er montert på et konfokalmikroskop for å registrere den intracellulære signaldynamikken via endringer i biosensorens fluorescensintensitet. Biosensoravbildning synkroniseres med samlingen av mikroperifusjonsavløp for den påfølgende analysen av insulin- og glukagonsekresjon⁷. Sammenlignet med makroperifusjon tillater denne mikroperifusjonsmetoden at færre pseudoisleter kan brukes på grunn av det mindre volumet av den mikrofluidiske enheten sammenlignet med makroperifusjonskammeret⁷.

For å utnytte nytten av dette systemet ble den sykliske adenosinmonofosfat (cAMP) differansedetektoren in situ (cADDis) biosensor uttrykt i humane pseudoislets for å vurdere cAMP-dynamikk og hormonsekresjon. cADDis-biosensoren består av et sirkulært permutert grønt fluorescerende protein (cpGFP) plassert i hengselområdet til et utvekslingsprotein aktivert av cAMP 2 (EPAC2), som forbinder dets regulatoriske og katalytiske regioner. Bindingen av cAMP til reguleringsregionen EPAC2 fremkaller en konformasjonsendring i hengselområdet som øker fluorescensen fra cpGFP¹³. Intracellulære budbringere som cAMP fremkaller insulin og glukagonsekresjon etter oppstrøms aktivering av G-proteinkoblede reseptorer¹⁴. Levende celleavbildning kombinert med mikroperifusjon bidrar til å koble den intracellulære cAMP-dynamikken med øyhormonsekresjon. Spesielt i denne protokollen genereres cADDis-uttrykkende pseudoisleter for å overvåke cAMP-responser i alfa- og beta-celler til forskjellige stimuli: lav glukose (2 mM glukose; G 2), høy glukose pluss isobutylmetylxanthin (IBMX; 20 mM glukose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX), og lav glukose pluss adrenalin (Epi; 2 mM glukose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Denne behandlingsarbeidsflyten gjør det mulig å vurdere den intracellulære cAMP-dynamikken direkte via 1) IBMX-mediert fosfodiesteraseinhibering, som forbedrer intracellulære cAMP-nivåer ved å forhindre nedbrytning, og 2) adrenalin, en kjent cAMP-avhengig stimulator for alfacelleglukagonsekresjon mediert av β-adrenerg reseptoraktivering. Trinnene for å sette opp mikroperifusjonsapparatet for levende cellebildeeksperimenter, lasting av pseudoislets i mikrochip, synkron levende celleavbildning og mikroperifusjon, og analysen av biosensorsporene og hormonsekresjonen ved mikroplatebaserte hormonanalyser er beskrevet nedenfor.

Protocol

Menneskelige øyer (N = 4 preparater) ble oppnådd gjennom partnerskap med Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. og Imagine Pharma. Vanderbilt University Institutional Review Board anser ikke avidentifiserte humane bukspyttkjertelprøver som forskning på mennesker. Dette arbeidet ville ikke vært mulig uten organdonorer, deres familier og organinnkjøpsorganisasjoner. Se tabell 1 for demografisk informasjon om donorer. Menneskelige øyer fra buk…

Representative Results

Biosensor-uttrykkende humane pseudoislets ble opprettet via adenoviral levering av konstruksjoner som koder for cAMP biosensor cADDis (figur 1A). Figur 1B viser reaggregering av de transduserte humane øyceller over tid, med fullt dannede pseudoislets observert etter 6 dager med kultur. Cellene begynte å vise synlig cADDis-fluorescens innen 48 timer, og det var høyt biosensoruttrykk i transduserte celler ved slutten av kulturperioden. Ved hjelp av den…

Discussion

Integrasjonen av et mikroperifusjonssystem, biosensoruttrykkende pseudoisleter og laserskanning konfokalmikroskopi muliggjør synkron vurdering av intracellulære signalhendelser og dynamiske hormonsekretoriske profiler. Det dynamiske mikroperifusjonssystemet kan levere en rekke veldefinerte stimuli til pseudoisletene og muliggjør oppsamling av avløpsvannet, der insulin- og glukagonkonsentrasjonene kan måles ved kommersielt tilgjengelig ELISA. Samtidig fanger levende celleavbildning av biosensoruttrykkende pseudoislet…

Materials

Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component