Псевдоостровковая система человека для синхронной оценки динамики флуоресцентных биосенсоров и секреторных профилей гормонов
Summary
В этом протоколе описан метод синхронного сбора и совместной регистрации внутриклеточных сигнальных событий и секреции инсулина и глюкагона первичными псевдоостровками человека с использованием аденовирусной доставки циклического биосенсора аденозинмонофосфата (цАМФ), детектора разности цАМФ in situ (cADDis) и микроперифузионной системы.
Abstract
Островки поджелудочной железы Лангерганса, представляющие собой небольшие 3D-скопления специализированных эндокринных и поддерживающих клеток, разбросанных по всей поджелудочной железе, играют центральную роль в контроле гомеостаза глюкозы через секрецию инсулина бета-клетками, что снижает уровень глюкозы в крови, и глюкагона альфа-клетками, что повышает уровень глюкозы в крови. Внутриклеточные сигнальные пути, в том числе опосредованные цАМФ, являются ключевыми для регулируемой секреции альфа- и бета-клеточных гормонов. Трехмерная структура островков, хотя и имеет важное значение для скоординированной функции островков, представляет собой экспериментальную проблему для механистических исследований внутриклеточных сигнальных путей в первичных островковых клетках человека. Для преодоления этих проблем и ограничений в данном протоколе описывается интегрированная визуализация живых клеток и микрофлюидная платформа с использованием первичных псевдоостровков человека, полученных от доноров без диабета, которые по своей морфологии, составу и функциям напоминают нативные островки. Размер этих псевдоостровков контролируется с помощью процесса диспергирования и реагрегации первичных островковых клеток человека. В дисперсном состоянии можно манипулировать экспрессией генов островковых клеток; Например, могут быть введены такие биосенсоры, как генетически кодируемый биосенсор цАМФ, cADDis. После образования псевдоостровки, экспрессирующие генетически кодируемый биосенсор, в сочетании с конфокальной микроскопией и микроперифузионной платформой позволяют синхронно оценивать динамику флуоресцентных биосенсоров и секреторные профили альфа- и бета-клеточных гормонов, чтобы обеспечить более глубокое понимание клеточных процессов и функций.
Introduction
Островки Лангерганса – это мини-органы, разбросанные по всей поджелудочной железе, функция которых имеет решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы. Инсулин секретируется из бета-клеток вслед за метаболизмом глюкозы, увеличением соотношения АТФ/АДФ, закрытием АТФ-чувствительных калиевых каналов, деполяризацией плазматической мембраны и притоком внеклеточного кальция1. Секреция глюкагона альфа-клетками менее изучена, но было постулировано, что внутриклеточные и паракринные пути способствуют экзоцитозу глюкагоновых гранул 2,3,4. Диабет 1 и 2 типа связаны с дисфункцией островковых клеток 5,6,7. Таким образом, выяснение внутриклеточных сигнальных путей, опосредующих секрецию островкового гормона, имеет важное значение для понимания физиологических и патологических механизмов островков поджелудочной железы.
Сферическая архитектура островков представляет определенные препятствия для экспериментов. Эти проблемы включают в себя изменчивость размеров островков и 3D-природу островков, которая снижает вирусную трансдукцию в ядре островка 8,9. Для преодоления этих проблем была разработана система псевдоостровков, в которой первичные островки человека рассредоточены по отдельным клеткам, аденовиридно трансдуцированы с помощью конструкций, кодирующих интересующие нас мишени, и реагрегированы с образованием островковых структур с контролируемым размером, называемых псевдоостровками7. По сравнению с нативными островками того же донора, которые культивировались параллельно, эти псевдоостровки сходны по морфологии, составу эндокринных клеток и секреции гормонов7. Этот метод позволяет экспрессировать конструкты по всему псевдоостровку, что означает, что он преодолевает предыдущий барьер для единообразных генетических манипуляций первичными человеческими островками 7,8,9.
В этом протоколе система псевдоостровков интегрирована с микрофлюидным устройством для экспрессии биосенсоров в первичных островковых клетках человека и получения временного разрешения секреции гормона псевдоостровков во время динамической перифузии10,11,12. Псевдоостровки помещают в микрочип и подвергают постоянному потоку различных секретагогов через перистальтический насос12. Микрочип имеет прозрачное стеклянное дно и устанавливается на конфокальный микроскоп для регистрации динамики внутриклеточной сигнализации через изменение интенсивности флуоресценции биосенсора. Биосенсорная визуализация синхронизируется со сбором микроперифузионных стоков для последующего анализа секреции инсулина и глюкагона7. По сравнению с макроперифузией, этот микроперифузионный подход позволяет использовать меньшее количество псевдоостровков из-за меньшего объема микрофлюидного устройства по сравнению с макроперифузионной камерой7.
Чтобы использовать полезность этой системы, биосенсор циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) дифференциальный детектор in situ (cADDis) был экспрессирован в псевдоостровках человека для оценки динамики цАМФ и секреции гормонов. Биосенсор cADDis состоит из циркулярно перестановленного зеленого флуоресцентного белка (cpGFP), расположенного в шарнирной области обменного белка, активируемого цАМФ2 (EPAC2), соединяя его регуляторную и каталитическую области. Связывание цАМФ с регуляторной областью EPAC2 вызывает конформационное изменение в шарнирной области, которое увеличивает флуоресценцию от cpGFP13. Внутриклеточные мессенджеры, такие как цАМФ, вызывают секрецию инсулина и глюкагона после активации рецепторов, связанных с G-белком14. Визуализация живых клеток в сочетании с микроперифузией помогает связать внутриклеточную динамику цАМФ с секрецией островкового гормона. В частности, в этом протоколе генерируются псевдоостровки, экспрессирующие cADDis, для мониторинга ответов цАМФ в альфа- и бета-клетках на различные стимулы: низкий уровень глюкозы (2 мМ глюкозы; G 2), высокое содержание глюкозы в сочетании с изобутилметилксантином (IBMX; 20 мМ глюкозы + 100 мкМ IBMX; G 20 + IBMX) и низкий уровень глюкозы плюс адреналин (Epi; 2 мМ глюкозы + 1 мкМ Epi; Г2 + Эпи). Этот рабочий процесс лечения позволяет оценить внутриклеточную динамику цАМФ непосредственно с помощью : 1) IBMX-опосредованного ингибирования фосфодиэстеразы, которое повышает внутриклеточный уровень цАМФ, предотвращая его деградацию, и 2) адреналина, известного цАМФ-зависимого стимулятора секреции альфа-клеточного глюкагона, опосредованного активацией β-адренергических рецепторов. Ниже подробно описаны этапы настройки микроперифузионного аппарата для экспериментов по визуализации живых клеток, загрузка псевдоостровков в микрочип, синхронная визуализация живых клеток и микроперифузия, а также анализ следов биосенсора и секреции гормонов с помощью гормональных анализов на основе микропланшетов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Интеграция микроперифузионной системы, псевдоостровков, экспрессирующих биосенсоры, и лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии позволяет синхронно оценивать внутриклеточные сигнальные события и динамические секреторные профили гормонов. Динамическая микроперифузионная сист…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Доноры органов и их семьи высоко ценятся за их бесценные пожертвования, а Международный институт организаций по закупке органов, развитию медицины (IIAM) и Национальный обмен исследованиями заболеваний (NDRI) получают признание за их партнерство в обеспечении доступности тканей поджелудочной железы человека для исследований. Эта работа была поддержана Исследовательской сетью островков человека (RRID:SCR_014393), Программой анализа поджелудочной железы человека (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 и DK20593 (Научно-исследовательский и учебный центр диабета Вандербильта), Благотворительным фондом Леоны М. и Гарри Б. Хелмсли, JDRF, Министерством по делам ветеранов США (BX000666), NIGMS Национальных институтов здравоохранения (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 и Национальный научный фонд (National Science Foundation Graduate Research Fellowship) (1937963).
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
