Denne metode eliminerer enhver større invasion under celleinjektioner forårsaget af cellesuspensionsopløsningen.
Direkte injektion af celler i væv er en nødvendig proces i celleadministration og / eller substitutionsterapi. Celleinjektionen kræver en tilstrækkelig mængde suspensionsopløsning for at tillade cellerne at komme ind i vævet. Suspensionsopløsningens volumen påvirker vævet, og dette kan forårsage større invasiv skade som følge af celleinjektionen. Dette papir rapporterer om en ny celleinjektionsmetode, kaldet langsom injektion, der sigter mod at undgå denne skade. Imidlertid kræver det en tilstrækkelig høj injektionshastighed i henhold til Newtons lov om forskydningskraft at skubbe cellerne ud af nålespidsen. For at løse ovenstående modsigelse blev en ikke-newtonsk væske, såsom gelatineopløsning, anvendt som cellesuspensionsopløsningen i dette arbejde. Gelatineopløsning har temperaturfølsomhed, da deres form skifter fra gel til sol ved ca. 20 °C. For at opretholde cellesuspensionsopløsningen i gelformen blev sprøjten derfor holdt afkølet i denne protokol; Men når opløsningen blev injiceret i kroppen, konverterede kropstemperaturen den til en sol. Den interstitielle vævsvæskestrøm kan absorbere overskydende opløsning. I dette arbejde tillod den langsomme injektionsteknik kardiomyocytkugler at komme ind i værtsmyokardiet og engraft uden omgivende fibrose. Denne undersøgelse anvendte en langsom injektionsmetode til at injicere oprensede og kugleformede neonatal rottekardiomyocytter i et fjerntliggende område af myokardieinfarkt i det voksne rottehjerte. 2 måneder efter injektionen viste hjerterne i de transplanterede grupper signifikant forbedret kontraktil funktion. Desuden afslørede histologiske analyser af de langsomt injicerede hjerter sømløse forbindelser mellem værts- og graftkardiomyocytterne via interkalerede diske indeholdende mellemrumsforbindelsesforbindelser. Denne metode kan bidrage til næste generations celleterapier, især inden for hjerteregenerativ medicin.
Celleadministration og udskiftning er lovende nye terapeutiske strategier for stærkt beskadigede organer. Blandt disse nye terapeutiske strategier har hjerteregenerativ medicin tiltrukket sig stor opmærksomhed. Imidlertid medierer betændelsen forårsaget af skader ardannelse i flere organer 1,2,3,4. Det menneskelige hjerte består af ca. 1010 kardiomyocytter; Derfor skal teoretisk 5,6 behandles med mere end 109 kardiomyocytter. Administration af et stort antal kardiomyocytter via traditionelle injektionsmetoder kan føre til betydelige vævsskader7. Denne metode giver en ny celleinjektionsmetode med minimal vævsinvasion.
Celleadministration i organets parenchyma kræver injektion(er). Der er imidlertid en uoverensstemmelse i, at selve injektionen kan føre til vævsskade. Vævsskade forårsager lokal betændelse og uhelbredelig ardannelse i organer og væv samt nedsat regenerativ evne 8,9,10. Pattedyrs hjerte har en ekstremt høj tilbøjelighed til at udvikle ar i stedet for at regenerere, fordi det kræver øjeblikkelig skadereparation for at udholde det høje blodtryk forårsaget af dets kontinuerlige pumpefunktion11. Ablationsterapi udnytter denne høje tilbøjelighed til ardannelse og blokerer kredsløbet, der sandsynligvis vil gennemgå ardannelse ved hjælp af arytmi12. I en tidligere undersøgelse blev det observeret, at arvævet isolerede de injicerede kardiomyocytter i værtsmyokardiet. Dette repræsenterer således det næste målproblem, der skal overvindes for at opnå forbedret terapeutisk effekt i hjerteregenerativ medicin.
Vævets interstitielle væskestrøm spiller en afgørende rolle i transporten af ilt og næringsstoffer til celler og fjernelse af det udskillede affald fra celler. Den fysiologiske hastighed af interstitiel væskestrøm i hvert væv/organ er forskellig (intervallet er 0,01-10 μm/s)13. Så vidt forfatteren ved, er der ingen data om de enkelte vævs/organers evne til at understøtte ekstra mængder væske uden patologisk ødem; Dette eksperiment forsøger imidlertid at bruge en langsom injektionshastighed til muligvis at reducere vævsskade, og resultaterne kan bruges til at bestemme det praktiske ved dette koncept.
Et af de kritiske punkter i den vellykkede udførelse af den langsomme injektionsmetode er forberedelsen af et effektivt injektionssystem ved hjælp af en kraftig sprøjtepumpe og et stærkt trykoverførselsrør. Et højtrykssystem er nødvendigt for at skubbe gel ud fra spidsen af en fin nål. Det andet kritiske punkt er stabiliseringen af hjertet. Hjertets slag mod en injektionsnål, der er avanceret ind i myokardiet, kan skade vævet. I denne undersøgelse blev der udført en ekkostyret injektion for at undgå, at dyrene gennemgik en anden åben brystskade og for at administrere celleinjektionen i et stabiliseret hjerte med lungerne oppustet. I nogle anvendelser til større dyr eller mennesker bør nogle injektionsanordninger, der er fastgjort til hjertet, desuden overvejes som en del af applikationens strategiske design. Til åbne brystinjektioner i små dyrs hjerter anbefales brug af en lang, fleksibel nål på grund af deres højere hjertefrekvens.
I dette arbejde øgede den langsomme injektionsmetode signifikant det overlevende kardiomyocytvolumen sammenlignet med den normale injektionsmetode. Den normale injektion forårsager celleskader via forskydningsspænding15. I modsætning hertil forårsager den langsomme injektionsmetode ikke sådan stress teoretisk, fordi den bruger en ikke-newtonsk opløsning ud over den langsomme injektion.
Med hensyn til lokal fibrose viste det interstitielle rum omkring de normalt injicerede overlevende kardiomyocytter stærk og udbredt type I kollagenaflejring. I modsætning hertil var type I-kollagensignalerne omkring de indpodede kardiomyocytter podet ved hjælp af den langsomme injektionsmetode meget svagere og mere begrænsede. Dette tyder på, at den langsomme injektionsmetode forårsagede betydeligt mindre skade. Den langsomme injektion af neonatale kardiomyocytter i det voksne myokardium forbedrede signifikant kontraktilfunktionen af det infarkte hjerte. De histologiske analyser antydede, at podning af kardiomyocytterne ved hjælp af langsom injektionsmetode resulterede i direkte forbindelser og funktionel kobling med værtskardiomyocytterne. Dette fænomen forklarer mekanismen for funktionel genopretning af værtsmyokardiet. Så vidt vi ved, er dette den første rapport om indpodede neonatale kardiomyocytter med store sømløse forbindelser til værtsvoksne kardiomyocytter. De funktionelle forbindelser med værtsmyokardiet via elektrisk og mekanisk kobling kan gøre de indpodede kardiomyocytter modne og give dem mulighed for at fungere som funktionelle myocytter, der bidrager til værtshjertefunktionen. Langsigtede fysiske kraftinteraktioner mellem værts- og transplantatkardiomyocytter er afgørende for fuld modning. Derfor kan det være nødvendigt med 2 måneder efter injektionen for funktionel genopretning af det infarkterede hjerte. Den tidsafhængige genopretning af patientens hjertefunktion kan være et forventet fænomen i terapeutiske anvendelser, og dette kan være et kendetegn ved en vellykket etablering af de novo funktionel kobling og integration mellem værten og podede kardiomyocytter.
Den langsomme injektionsmetode kan udføres under åben brystkirurgi. Desuden kan denne metode anvendes på mus. For fremtidige anvendelser inden for human terapi skal vi stadig løse flere problemer. Injektionshastigheden bør optimeres ved at overveje bufferkapaciteten af den interstitielle væskestrøm i hvert humant målorgan. Der bør anvendes xenofrie materialer, såsom gelatine fra mennesker eller biologisk nedbrydelige syntetiske materialer. Der bør udvikles kliniske apparater til langsom injektion af GMP-kvalitet, såsom kompakte organspecifikke engangsværktøjer eller et genanvendeligt apparat til brede organer.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra JSPS KAKENHI (bevilling nr. 23390072 og 19K07335) og AMED (bevilling nr. A-149).
18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |