Denne metoden eliminerer enhver større invasjon under celleinjeksjoner forårsaket av cellesuspensjonsløsningen.
Direkte injeksjon av celler i vev er en nødvendig prosess i celleadministrasjon og / eller erstatningsterapi. Celleinjeksjonen krever en tilstrekkelig mengde suspensjonsløsning for å tillate cellene å komme inn i vevet. Volumet av suspensjonsoppløsningen påvirker vevet, og dette kan forårsake stor invasiv skade som følge av celleinjeksjonen. Dette papiret rapporterer om en ny celleinjeksjonsmetode, kalt langsom injeksjon, som tar sikte på å unngå denne skaden. Å skyve ut cellene fra nålespissen krever imidlertid en tilstrekkelig høy injeksjonshastighet i henhold til Newtons lov om skjærkraft. For å løse den ovennevnte motsetningen ble en ikke-newtonsk væske, slik som gelatinløsning, brukt som cellesuspensjonsløsning i dette arbeidet. Gelatinløsning har temperaturfølsomhet, da formen endres fra gel til sol ved ca. 20 °C. Derfor, for å opprettholde cellesuspensjonsløsningen i gelformen, ble sprøyten holdt avkjølt i denne protokollen; Men når løsningen ble injisert i kroppen, konverterte kroppstemperaturen den til en sol. Den interstitielle vevsvæskestrømmen kan absorbere overflødig løsning. I dette arbeidet tillot den langsomme injeksjonsteknikken kardiomyocyttkuler å komme inn i vertsmyokardiet og engraft uten omgivende fibrose. Denne studien benyttet en langsom injeksjonsmetode for å injisere rensede og ballformede neonatale rottekardiomyocytter i et avsidesliggende område av hjerteinfarkt i det voksne rottehjertet. Ved 2 måneder etter injeksjonen viste hjertene til de transplanterte gruppene signifikant forbedret kontraktil funksjon. Videre viste histologiske analyser av langsomt injiserte hjerter sømløse forbindelser mellom verten og transplantatkardiomyocytter via interkalerte skiver med gap-junction-forbindelser. Denne metoden kan bidra til neste generasjons celleterapi, spesielt innen hjerteregenerativ medisin.
Celleadministrasjon og erstatning er lovende nye terapeutiske strategier for tungt skadede organer. Blant disse nye terapeutiske strategiene har hjerteregenerativ medisin tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet. Betennelsen forårsaket av skader medierer imidlertid arrdannelse i flere organer 1,2,3,4. Det menneskelige hjerte består av ca.10 kardiomyocytter; Derfor, teoretisk5,6, må den behandles med mer enn 109 kardiomyocytter. Administrering av et stort antall kardiomyocytter via tradisjonelle injeksjonsmetoder kan føre til betydelige vevsskader7. Denne metoden gir en ny celleinjeksjonsmetode med minimal vevsinvasjon.
Celleadministrasjon i organparenkymet krever injeksjon(er). Imidlertid eksisterer det en uoverensstemmelse ved at injeksjonen i seg selv kan føre til vevsskade. Vevsskade gir lokal inflammasjon og uhelbredelig arrdannelse i organer og vev, samt nedsatt regenerativ evne 8,9,10. Pattedyrhjertet har en ekstremt høy tilbøyelighet til å utvikle arr i stedet for å regenerere fordi det krever umiddelbar skadereparasjon for å tåle det høye blodtrykket forårsaket av den kontinuerlige pumpefunksjonen11. Ablasjonsterapi utnytter denne høye tilbøyeligheten til arrdannelse og blokkerer kretsen som sannsynligvis vil gjennomgå arrdannelse ved bruk av arytmi12. I en tidligere studie ble det observert at arrvevet isolerte de injiserte kardiomyocyttene i vertsmyokardiet. Dermed representerer dette det neste målproblemet som må overvinnes for å oppnå forbedret terapeutisk effekt innen hjerteregenerativ medisin.
Interstitiell væskestrøm i vev spiller en viktig rolle i å transportere oksygen og næringsstoffer til celler og fjerne det utskilte avfallet fra cellene. Den fysiologiske hastigheten på interstitiell væskestrøm i hvert vev/organ er forskjellig (området er 0,01-10 μm/s)13. Så vidt forfatteren vet, er det ingen data om kapasiteten til individuelle vev / organer for å støtte ekstra mengder væske uten patologisk ødem; Imidlertid forsøker dette eksperimentet å bruke en langsom injeksjonshastighet for å muligens redusere vevskader, og resultatene kan brukes til å bestemme det praktiske ved dette konseptet.
Et av de kritiske punktene i den vellykkede ytelsen til den langsomme injeksjonsmetoden er utarbeidelsen av et effektivt injeksjonssystem ved hjelp av en kraftig sprøytepumpe og et sterkt trykkoverføringsrør. Et høytrykkssystem er nødvendig for å skyve gel ut fra spissen av en fin nål. Det andre kritiske punktet er stabilisering av hjertet. Hjerteslag mot en injeksjonsnål som føres inn i myokardiet, kan skade vevet. I denne studien ble det utført en ekkoveiledet injeksjon for å unngå at dyrene gjennomgikk en ny åpen brystskade og for å administrere celleinjeksjonen i et stabilisert hjerte med lungene oppblåst. Videre, i noen applikasjoner for større dyr eller mennesker, bør noen injeksjonsutstyr festet på hjertet betraktes som en del av den strategiske utformingen av applikasjonen. For åpne brystinjeksjoner i hjertene til små dyr, anbefales bruk av en lang, fleksibel nål gitt deres høyere hjertefrekvens.
I dette arbeidet økte den langsomme injeksjonsmetoden signifikant det overlevende kardiomyocyttvolumet sammenlignet med normal injeksjonsmetode. Den normale injeksjonen forårsaker celleskade via skjærspenning15. I motsetning til dette forårsaker den langsomme injeksjonsmetoden ikke slik stress teoretisk fordi den bruker en ikke-newtonsk løsning i tillegg til den langsomme injeksjonen.
Når det gjaldt lokal fibrose, viste det interstitielle rommet rundt de normalt injiserte overlevende kardiomyocyttene sterk og utbredt type I kollagenavleiring. I motsetning til dette var type I-kollagensignalene rundt de innpodede kardiomyocyttene podet ved hjelp av langsom injeksjonsmetode mye svakere og mer begrenset. Dette antyder at den langsomme injeksjonsmetoden forårsaket betydelig mindre skade. Den langsomme injeksjonen av neonatale kardiomyocytter i det voksne myokardiet forbedret signifikant kontraktilfunksjonen til det infarkterte hjertet. De histologiske analysene antydet at poding av kardiomyocyttene med langsom injeksjonsmetode resulterte i direkte forbindelser og funksjonell kobling med vertkardiomyocyttene. Dette fenomenet forklarer mekanismen for funksjonell gjenoppretting av vertsmyokardiet. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten om transplanterte neonatale kardiomyocytter med storskala sømløse forbindelser til verten voksne kardiomyocytter. De funksjonelle forbindelsene med vertsmyokardiet via elektrisk og mekanisk kobling kan gjøre de engraftede kardiomyocyttene modne og tillate dem å fungere som funksjonelle myocytter som bidrar til vertshjertefunksjonen. Langsiktige fysiske kraftinteraksjoner mellom verten og transplantatkardiomyocytter er avgjørende for full modning. Derfor kan det være nødvendig med 2 måneder etter injeksjonen for funksjonell gjenvinning av infarkthjertet. Den tidsavhengige gjenopprettingen av pasientens hjertefunksjon kan være et forventet fenomen i terapeutiske applikasjoner, og dette kan være et kjennetegn på vellykket etablering av de novo funksjonell kobling og integrasjon mellom verten og podede kardiomyocytter.
Den langsomme injeksjonsmetoden kan utføres under åpen brystkirurgi. I tillegg kan denne metoden brukes på mus. For fremtidige anvendelser i humanterapi må vi fortsatt løse flere problemer. Injeksjonshastigheten bør optimaliseres ved å ta hensyn til bufferkapasiteten til den interstitielle væskestrømmen i hvert humant målorgan. Xenofrie materialer, som gelatin fra mennesker eller biologisk nedbrytbare syntetiske materialer, bør brukes. Klinisk GMP-grad langsom injeksjonsapparat, slik som kompakte organspesifikke engangsverktøy eller et gjenbrukbart bredt organ anvendelig apparat, bør utvikles.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av et tilskudd fra JSPS KAKENHI (Grant No. 23390072 og 19K07335) og AMED (Grant No. A-149).
18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |