Summary
Denne protokol beskriver proceduren for genomredigering i museknoglemarvsafledte makrofager ved anvendelse af Cas9-sgRNA ribonukleoproteinkomplekser samlet in vitro og leveret ved elektroporation.
Abstract
Knoglemarvsafledte makrofager (BMDM'er) fra mus er et vigtigt redskab til at studere den komplekse biologi af vævsmakrofager. Som primære celler modellerer de fysiologien af makrofager in vivo tættere end udødeliggjorte makrofagcellelinjer og kan udledes af mus, der allerede bærer definerede genetiske ændringer. Imidlertid er forstyrrelse af genfunktionen i BMDM'er fortsat teknisk udfordrende. Her leverer vi en protokol til effektiv CRISPR/Cas9-genomredigering i BMDM'er, som giver mulighed for introduktion af små insertioner og deletioner (indels), der resulterer i frameshift-mutationer, der forstyrrer genfunktionen. Protokollen beskriver, hvordan man syntetiserer enkeltguide-RNA'er (sgRNA-Cas9) og danner oprensede sgRNA-Cas9-ribonukleoproteinkomplekser (RNP'er), der kan leveres ved elektroporation. Det giver også en effektiv metode til overvågning af redigeringseffektivitet ved hjælp af rutinemæssig Sanger-sekventering og et frit tilgængeligt online analyseprogram. Protokollen kan udføres inden for 1 uge og kræver ikke plasmidkonstruktion; Det resulterer typisk i 85% til 95% redigeringseffektivitet.
Introduction
Makrofager er medfødte immunceller, der spiller kritiske roller i vævsreparation og immunitet 1,2. Udødeliggjorte makrofagcellelinjer, såsom mus RAW 264.7-celler eller humane THP-1-celler, har flere gavnlige egenskaber, herunder robust vækst og let genforstyrrelse ved at levere vektorer til RNA-interferens eller CRISPR / Cas9 3,4. Imidlertid ændrer onkogen transformation dramatisk deres fysiologi, hvilket resulterer i den afvigende aktivering af nogle veje og dæmpede reaktioner fra andre 5,6. Primære knoglemarvsafledte makrofager (BMDM'er) rekapitulerer tættere in vivo makrofagfysiologi, men forbliver udfordrende at genetisk manipulere på grund af den lave effektivitet af både plasmidtransfektion og viral transduktion i disse primære immunceller 7,8. Der er således behov for mere effektive metoder til at forstyrre genfunktionen.
CRISPR/Cas9 genomredigering er et kraftfuldt værktøj til genetisk manipulation på tværs af en række biologiske systemer, herunder pattedyrceller 9,10,11,12. Streptococcus pyogenes Cas9-proteinet spalter effektivt og specifikt dobbeltstrenget DNA, når det er kompleksbundet med et sekvensspecifikt guide-RNA. DNA-reparation gennem den ikke-homologe endesammenføjning (NHEJ) af det spaltede DNA resulterer i små indsættelser eller deletioner (indels), der skaber frameshift-mutationer. I tidlige undersøgelser blev Cas9 og sgRNA'er leveret gennem plasmid- eller lentivirale vektorer, som er effektive leveringsmetoder for mange cellelinjer 9,10. Imidlertid er primære celler og især primære immunceller ofte ildfaste over for disse metoder på grund af den lave effektivitet af vektorlevering ved transfektion eller transduktion. Efterfølgende er der udviklet metoder til at generere sgRNA-Cas9-komplekser in vitro og levere dem via elektroporation, og disse metoder har opnået høj effektivitet i en række celletyper13,14. Resultaterne har antydet muligheden for at bruge denne tilgang til at udføre genomredigering i primære makrofager.
Her leverer vi en protokol til brug af sgRNA-Cas9 ribonukleoproteinkomplekser (RNP'er) til at udføre genomredigering i primære BMDM'er. Den indeholder trin til at afbøde aktiveringen af immunsensorerne, der findes i primære immunceller og resulterer i op til 95% redigering på målrettede loci med minimal toksicitet. Denne protokol omfatter også arbejdsgange til evaluering af redigeringseffektivitet ved hjælp af rutinemæssig polymerasekædereaktion (PCR) og Sanger-sekventering efterfulgt af in silico-analyse ved sporing af Indels by Decomposition (TIDE)15, et velvalideret online softwareværktøj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-design
BEMÆRK: Dette trin beskriver valg af målsekvenser og design af sgRNA'erne. Det er nyttigt at designe guider, der er i den første store kodende exon, så ethvert oversat protein forstyrres tidligt i den åbne læseramme. Det er også nyttigt at vælge målsekvenser, der ligger inden for samme exon, da dette vil strømline analysen af redigeringseffektiviteten (trin 6). Eksemplerne på genomredigering, der leveres med denne protokol, brugte sgRNA'er rettet mod den første exon af Src-genet og Cblb-genet såvel som i det ikke-kodende Rosa26-locus i musegenomet.
- Identificer 20 nukleotidgenomsekvenser, der skal målrettes, ved hjælp af et af flere gratis online designværktøjer (tabel 1). Vælg fire til fem guider, der ikke overlapper hinanden inden for hvert gen, da Cas9-aktiviteten varierer efter den valgte specifikke guide, og a priori forudsigelse af en meget aktiv guide er ikke mulig.
BEMÆRK: Det er afgørende at sikre korrekt orientering af guiden i forhold til sekvensen af det målrettede locus. Designværktøjer giver typisk føringssekvensen i en 5' til 3' orientering, uanset hvilken kromosomstreng der er målrettet. For at verificere strengorienteringen skal du kontrollere, at der er en protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens for S. pyogenes Cas9 (nGG) umiddelbart 3' af den målrettede genomiske sekvens. SgRNA-sekvensen inkluderer ikke PAM.
2. sgRNA-syntese
BEMÆRK: Dette trin beskriver, hvordan man syntetiserer sgRNA'er ved hjælp af PCR til at generere en skabelon til in vitro-transkription (IVT) og derefter renser sgRNA'et ved hjælp af spinkolonner (figur 1A). Brugerdefinerede syntetiske sgRNA'er er kommercielt tilgængelige gennem flere leverandører som et alternativ til PCR / IVT.
- Udfør PCR for at generere IVT-skabelonen for T7 RNA-polymerase. PCR-reaktionen bruger universelle primere, der indeholder en T7 RNA-polymerasepromotor og transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA) sekvens (tabel 2), ud over korte individuelle primere med den genspecifikke guidesekvens.
- Dette er det ikke-forstærkende overlapningsudvidelsestrin. PCR-bufferen fortyndes til 1x, og der tilsættes yderligere 1 mM MgCl2. Derefter tilsættes 0,25 μL high-fidelity DNA-polymerase, 0,5 mM deoxynukleotidtrifosfat (dNTP), 0,02 mM guidespecifik primer og 0,02 mM T7 omvendt lang universalprimer (tabel 2) til et samlet volumen på 46 μL. Derefter anbringes røret i termocyklisten og køres to cyklusser på: 95 °C i 15 s, 37 °C i 15 s og 72 °C i 15 s. Afkøl reaktionerne på is.
- Dette er PCR-forstærkningstrinnet. Til hver reaktion tilsættes 2 μL 25 mM fremadgående forstærkningsprimer og 2 μL 25 mM omvendt forstærkningsprimer. Det endelige reaktionsvolumen er 50 μL. Denaturer i 30 s ved 95 °C. Kør derefter 35 cyklusser med: 95 °C i 15 sekunder, 65 °C i 20 sek. og 72 °C i 15 sek. Udfør en ekstra forlængelse ved 72 °C i 2 min.
- Kontroller PCR-reaktionsproduktet på en 2% agarosegel. Overlap-extension PCR resulterer i et 127 bp dsDNA-molekyle med T7-promotoren opstrøms for den genspecifikke 20 nukleotidguide og tracrRNA'et umiddelbart nedstrøms (figur 1B).
- IVT-skabelonrensning: Der er adskillige protokoller og kits, der fungerer godt til dette. Denne protokol bruger fastfase-reversibel immobilisering (SPRI) perler. Bland 50 μL af PCR-produktet med 90 μL perler, og følg producentens anvisninger. Eluer DNA'et ved at tilsætte 40 μL buffer (5 mM Tris, 0,1 mM ethylendiamintetraeddikesyre [EDTA]) og opvarm ved 65 °C i 5 min.
- Mål DNA-koncentrationen af IVT-skabelonen ved hjælp af absorption ved en bølgelængde på 260 nm. En DNA-koncentration på mindst 50 ng/μL er nødvendig for IVT. IVT-skabelonen kan opbevares ved -20 °C.
- IVT reaktion
- Brug et kommercielt sæt designet til at producere høje udbytter af IVT (se tabel over materialer). Følg producentens anbefalinger for at udføre IVT-reaktionen. Ved hjælp af 250 ng IVT-skabelon i en 20 μL reaktion inkuberes ved 37 °C i 4-16 timer.
- Kontroller IVT sgRNA-produktet ved at køre 1 μL af reaktionen på en 2% agarosegel. Et lyst RNA-bånd skal observeres, der kører på samme måde som 70 bp dsDNA (figur 1C). Selvom det ikke er obligatorisk, skal du bruge en RNA-prøvebuffer med urinstof for at opnå skarpe og mere opløste bånd og denaturere prøven ved 65 ° C i 5 minutter før påfyldning.
BEMÆRK: Svage bånd med højere molekylvægt og små migrationsforskelle kan ses med nogle guide-RNA'er på grund af forskelle i RNA's sekundære struktur.
- Dephosphorylerer sgRNA IVT-produktet for at minimere aktiveringen af RIG-I (en fremmed RNA-sensor) og efterfølgende celledød efter elektroporation. For hver 20 μL IVT-reaktion tilsættes 69 μL molekylvand og 15 U kalvetarmfosfatase (CIP) i 1x CIP-buffer. Der inkuberes i 2 timer ved 37 °C.
- Nedbryd IVT-skabelonen for at minimere aktiveringen af cellulære DNA-sensorer, som udløser celledød efter elektroporation. Til hver IVT-reaktion tilsættes 2 U RNase-fri DNase. Der inkuberes i 15 minutter ved 37 °C. IVT-produktet kan opbevares ved -20 °C i 1 dag eller -80 °C i flere måneder.
- Rens IVT-produktet ved hjælp af centrifugeringskolonner. Til dette trin er SPRI-perlerensningssæt ringere.
- Bind RNA'et til kolonnen ved at tilsætte 220 μL bindingsbuffer til IVT-produktet efterfulgt af 1 ml ethanol af 100% molekylærbiologikvalitet. Bland godt og læg søjlen. Følg derefter producentens anvisninger. Udfør den endelige vask i et laminar flow biosikkerhedsskab for at undgå forurening af sgRNA'et.
- Eluering i laminar flowhætte udføres for at undgå kontaminering. Eluer RNA'et ved hjælp af 30 μL steril 10 mM Tris buffer (pH 8,0).
- Målt koncentrationen af sgRNA ved at måle absorbansen ved en bølgelængde på 260 nm.
BEMÆRK: Typiske sgRNA-udbytter er mindst 100 μg. - SgRNA'et opbevares ved -80 °C. Lav alikvoter for at undgå mere end tre fryse-optøningscyklusser.
3. Forberedelse til elektroporation
BEMÆRK: Alle trin skal udføres i en laminar strømningshætte for at undgå kontaminering. Denne protokol bruger et kommercielt tilgængeligt elektroporationssystem (se materialetabel) med 10 μL spidser.
- BMDM'erne tøs op 48-72 timer før brug, og udvid dem på ikke-vævskulturbehandlede plader (TC).
BEMÆRK: Pr. reaktion er der brug for 4 x 105 celler. - Steriliser PCR-rør til reaktionssamling. Forbered et PCR-rør pr. reaktion, og opvarm dem i en termocyklisk maskine i 10 minutter ved 98 °C. Forbered rørene i partier og opbevar dem lukket. Placer de steriliserede PCR-rør på is, når de er klar til brug.
- Rengør pipettestationen med 70 % ethanol, og anbring den i laminar flow-emhætten. Indstil parametrene til 1.900 V, 20 ms og en puls.
- Fjern et transfektionsrør fra pakningen med omhu for at holde det sterilt og fyld det med 3 ml "E" buffer. Sørg for, at E-bufferen er ved stuetemperatur inden elektroporering. Indsæt røret i stationen, og skub det ned, indtil det klikker.
- For hver reaktion alikvote 2,5 μL sgRNA i en koncentration på 1.100 ng/μL. SgRNA'et fortyndes i koldt fosfatbufret saltvand (PBS) med 0,9 mMCaCl2 og 0,5 mMMgCl2 (PBS + Ca/Mg). Lad det ligge på is.
- Forbered to plader: en 12-brønds ubelagt plade til cellerne og en yderligere 24-brønds plade til at holde kulturmediet. Alikvote 1,5 ml antibiotikafrit medium pr. reaktion i brøndene på 24-brøndpladen.
- Forbered Cas9 protein. Der er flere kommercielle og akademiske leverandører af sterilt renset Cas9-protein. Cas9 fortyndes til en slutkoncentration på 20 μM med kold PBS + Ca/Mg. For hver elektroporationsreaktion alikvote 1 μL 20 μM Cas9 i sterile PCR-rør. Lad være på is.
- Forbered celler til elektroporation.
- Fjern vækstmediet. Vask cellerne med PBS udenCaCl2 ogMgCl2 (PBS-Ca/Mg) for at fjerne serum og divalente kationer, der fremmer vedhæftning. Derefter tilsættes PBS + 1 mM EDTA og inkuberes ved stuetemperatur i ca. 5 minutter, indtil cellerne begynder at løsne sig.
- Pipetten pipetteres forsigtigt op og ned for at løsne cellerne. Overfør cellerne til et lavproteinbindende 15 ml rør. Pillecellerne ved 500 x g i 5 min.
BEMÆRK: Makrofager klæber til plastvarer. Anvendelsen af lavproteinbindende centrifugerør forbedrer celleudbyttet betydeligt. - Arbejd hurtigt for at undgå langvarig inkubation af celler i PBS + EDTA. Det meste af supernatanten fjernes, så der er ca. 1 ml supernatant tilbage i glasset. Cellerne i den resterende supernatant resuspenderes og overføres derefter til et 1,5 ml mikrofugerør med lavt proteinbindende.
- Fjern en lille delprøve af celler, der skal tælles. Pellet de resterende celler ved centrifugering ved 500 x g ved stuetemperatur i 5 min.
- Under centrifugering tælles cellerne og Cas9- og sgRNA-rørene opvarmes til stuetemperatur.
- Al supernatanten fjernes fra cellepelletsen. Resuspender cellerne i PBS + Ca/Mg i en koncentration på 4 x 107 celler/ml (4 x 105 celler pr. 10 μL reaktion).
BEMÆRK: Hvert sæt leveres med en begrænset mængde elektroporationsbuffer (buffer R, buffer T). Vi finder imidlertid, at elektroporationseffektiviteten ved hjælp af PBS + Ca / Mg svarer til de proprietære buffere. - Når du elektroporerer sgRNA'er for forskellige gener, alikvote cellerne i forskellige lavproteinbindende rør for hvert gen for at undgå krydskontaminering mellem sgRNA'erne. Opbevar cellerne ved stuetemperatur, indtil de er klar til elektroporation.
4. RNP-samling
- Hold sgRNA og Cas9 ved stuetemperatur for at undgå nedbør. Tilsæt 2,5 μL sgRNA til 1 μL af den fortyndede Cas9 i steriliserede PCR-rør. Dispenser sgRNA'et langsomt over 15 s med blanding for at forhindre udfældning.
- Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur for at tillade dannelse af RNP-kompleks.
5. RNP-levering ved elektroporation
- Forbered elektroporationsspidsen (kuvette). Tryk stemplet ned for at forlænge stilken. Indsæt stammen i spidsen.
BEMÆRK: Sørg for, at spidsen er sikker, og at stemplet glider jævnt og strækker sig ud over spidsskeden. Hvis spidsen ikke er korrekt placeret, kan der indføres luftbobler i spidsen, hvilket forårsager spidsfejl. - Resuspender cellerne ved pipettering op og ned, og læg derefter elektroporationsspidsen med cellerne. Udtræk spidsens fulde volumenkapacitet på 10 μL, og undgå bobler.
- Start med det negative kontrol-sgRNA, overfør 10 μL celler i elektroporationsspidsen til prøveglasset indeholdende 3,5 μL RNP fra trin 4. Pipette op og ned tre gange for at blande godt. Træk 10 μL af blandingen tilbage i spidsen, og sørg for, at der ikke er bobler til stede.
- Placer spidsen i elektroporationsstationen, sænk den ned i bufferen. Undgå at komme i kontakt med plastoverflader med spidsen for at opretholde steriliteten. Tryk på Start på touchskærmen.
- Efter afslutningen angiver displayet en vellykket puls. Fjern pipetten fra enheden, og anbring cellerne i en tør brønd på den mærkede, ubelagte 12-brøndplade.
- Skyl spidsen ved at pipettere op og ned to gange i 15 ml PBS + Ca/Mg. Sæt pipetten til side med spidsen stadig påsat. Sørg for, at spidsen ikke rører ved noget og forbliver steril.
BEMÆRK: I mange eksperimenter er det muligt at genbruge spidsen til flere prøver, såsom efter den inaktive negative kontrol-sgRNA-prøve eller under de indledende evalueringer af guideaktiviteten, når fire til fem sgRNA'er testes pr. gen, og den eneste aflæsning er redigeringseffektiviteten. Under funktionel analyse på redigerede celler anbefales der dog et nyt tip til hvert gen, da små mængder sgRNA eller celleoverførsel kan påvirke de eksperimentelle resultater. - Tilsæt straks 1 ml antibiotikafrit medium (aliquoteret i trin 3.6) til cellerne og ryst forsigtigt pladen for at blande.
- Gentag trin 5.2-5.6 for de resterende reaktioner.
- Returner cellerne til inkubatoren.
- Kontroller cellernes levedygtighed 1-2 timer efter elektroporation. Cellerne skal være >90% klæbende. Valgfrit: Tilføj gentamicin (5 μg / ml) til cellerne 1-2 timer efter elektroporation for at forhindre kontaminering, hvis dette ikke vil forstyrre nedstrømsforsøgene.
6. Vurdering af redigeringseffektiviteten
BEMÆRK: De fleste redigeringer er afsluttet efter 48 timer.
- Kontroller cellemonolaget 48 timer efter elektroporation. Hvis cellerne er over 50% sammenflydende, skal du fortsætte videre. Hvis cellerne er <50% sammenflydende, skal du vente yderligere 1-2 dage. Den genomiske DNA-analyse til bestemmelse af redigeringseffektiviteten kræver 1 x 105 celler ud over de celler, der er nødvendige for nedstrømseksperimentet.
- Forbered genomisk DNA (gDNA).
- Cellerne vaskes med PBS(-Ca/Mg). Tilsæt 1 ml PBS + 1 mM EDTA. Inkuber ved stuetemperatur i ca. 5 minutter, indtil cellerne begynder at løsne sig fra pladen.
- Fjern cellerne ved pipettering. Overfør til et mikrofugerør med lavt proteinbindingsindhold.
- Tæl cellerne og fjern en prøve på 1 x 105 celler. De resterende celler kan genbelægges til brug i yderligere forsøg. Generelt udføres eksperimenterne 5 dage efter elektroporation for at tillade henfald af proteinet.
- Pellet cellerne til gDNA-analyse i 15 s ved maksimal hastighed i et mikrofugerør.
- Pellet resuspenderes i 50 μL lysisbuffer. Vortex for at løsne celler, der sidder fast på rørets vægge, og opvarm ved 98 ° C i 10 minutter for at lyse cellerne og inaktivere endogen DNase.
- Placer rørene på is.
- Der tilsættes 1 μL proteinase K (20 mg/ml). Der inkuberes i mindst 1 time ved 37 °C Det kan efterlades natten over for nemheds skyld.
- Der opvarmes til 98 °C i 10 minutter for at inaktivere proteinasen K.
- Centrifuger ved stuetemperatur i 5 min ved maksimal hastighed. Supernatanten, som indeholder DNA'et, fjernes. Dette rå præparat uden yderligere rensning fungerer godt til de fleste PCR-reaktioner.
- Evaluer redigeringseffektiviteten med Sanger-sekventering.
- Design PCR-primere 200-300 bp opstrøms for de fleste 5' guidesteder og 200-300 bp nedstrøms for de mest 3' guidesteder. Den typiske amplicon størrelse er ~ 500 bp. Design en indlejret sekventeringsprimer mindst 125 bp væk fra det nærmeste styrested (figur 2A).
- Udfør PCR ved hjælp af 2 μL gDNA.
- Forbered PCR-produktet til sekventering. Denne protokol bruger en exonuclease I / rejer alkalisk fosfatase (ExoI / SAP) behandling. Kommercielle DNA-oprensningssæt fungerer også, men kræver mere praktisk tid.
- Forbered 15 μL af PCR-produktet. Tilsæt 7,5 μL vand, 1 μL 10x ExoI-buffer, 10 U ExoI og 1 U SAP for at nedbryde dNTP'erne og primerne, der forstyrrer Sanger-sekventering.
- Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter, efterfulgt af 85 °C i 20 minutter for at deaktivere enzymerne.
- Udfør Sanger-sekventering på det Exo/SAP-behandlede PCR-produkt; bruge en kendt mængde DNA-størrelsesmarkør til at estimere størrelsen af det PCR-produkt, der er til stede i prøven. Sekventeringsreaktionerne kan kræve optimering, da TIDE-softwaren har brug for sekvenskromatogrammer af høj kvalitet for nøjagtigt at estimere redigeringseffektiviteten. Sekvenskromatogrammet for det uredigerede locus skal give klare toppe med minimal baggrund (figur 2B, C).
- For at estimere redigeringseffektiviteten skal du bruge TIDE til at analysere Sanger-sekventeringskromatogramfilerne ved hjælp af det redigerede gDNA og det uredigerede kontrol-gDNA. (tabel 1, figur 2). Upload Sanger-sekventeringsfilerne, og kør softwaren med standardindstillingerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVT-skabelonen er et 127 bp PCR-produkt (figur 1B). IVT-produktet i fuld længde er et 98 nt RNA, som migrerer på samme måde som et 70 bp dobbeltstrenget DNA-fragment (figur 1C).
Efter elektroporation skal cellerne være >90% levedygtige med et samlet celletal på >70% af startcellenummeret. Den resulterende pulje af mutantceller skal have et forskelligt sæt indels, der starter nær Cas9-spaltningsstedet. Analysen af de målrettede gener ved PCR- og Sanger-sekventering skulle vise flere nukleotider på hver position nedstrøms for Cas9-spaltningsstedet (figur 2).
Figur 1: Oversigt over sgRNA-Cas9-redigeringsprocessen. (A) Skematisk for guidedesign, sgRNA-generering og Cas9-sgRNA-levering. (B) PCR-produktet fra IVT for Src sgRNA'er 1, 2 og 3 opløst på en 2% agarosegel. Pilen angiver de korrekte 127 bp PCR-produkter. (C) RNA-produkterne efter IVT for Src sgRNA'er 1, 2 og 3 opløst på en 2% agarosegel. Parenteserne angiver de korrekte sgRNA-produkter. Den variable migration af sgRNA'et skyldes RNA sekundær struktur. Denne figur er genoptrykt fra førsteforfatterens speciale16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Høj redigeringseffektivitet opnået for flere målrettede gener. (A) Skematisk oversigt over PCR- og Sanger-sekventeringsprimere. (B) Skematisk oversigt over arbejdsgangen for TIDE for at vurdere redigeringseffektiviteten. C) repræsentativt Sanger-sekventeringskromatogram af ROSA26-locus fra BMDM'er elektroporeret med et ikke-målrettet sgRNA-Cas9 RNP (øverst) og ROSA26-specifikt sgRNA (nederst) Cas9-spaltningsstedet er fremhævet. TIDE-udgangen (højre) med den beregnede redigeringseffektivitet og procentdelen af sekvenser, der indeholder det angivne antal indels. (D,E) Sanger-sekventering af kromatogrammer af (D) Src - og Cblb-generne i de redigerede BMDM'er. Denne figur er genoptrykt fra førsteforfatterens speciale16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Moderat stigning i redigeringseffektivitet på grund af den kommercielle elektroporationsforstærker. BMDM'erne blev elektroporeret med laveffektive guider til evaluering af effekten af en kommerciel redigeringsforstærker. Før elektroporation blev 1 μL af forstærkeren tilsat til de samlede RNP'er til en slutkoncentration på 4 μM. Redigeringseffektiviteten af det angivne Src sgRNA blev evalueret ved hjælp af TIDE. Denne figur er genoptrykt fra førsteforfatterens speciale16. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Værktøjets navn | URL-adresse | ||
| Synthego - CRISPR Design Tool | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| Det Brede Institut - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Sporing af indels ved nedbrydning (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Tabel 1: URL-adresser til onlineværktøjer.
| Primer navn | Sekvens | ||
| Guide-specifik primer | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Guide-specifik primer - Cbl-b Guide 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Guide-specifik primer - Cbl-b Guide 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Guide-specifik primer - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGATgttttagagctagaa | ||
| Guide-specifik primer - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Guide-specifik primer - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Guide-specifik primer - Src Guide 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Guide-specifik primer - Src Guide 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 omvendt lang universel primer | aaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac | ||
| Universal Forward Amplification Primer | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| Universal omvendt forstærkningsprimer | aaaaagcaccgactcgg | ||
Tabel 2: Oligonukleotider anvendt i PCR til at generere skabelonen til IVT af sgRNA'et. De 20 nukleotidmålsekvenser for genspecifikke primere aktiveres.
| BMDM Vækst medier. Opbevares ved 4 C. | |||
| DMEM | |||
| Føtalt bovin serum | 0.1 | ||
| L-glutamin | 0,2 m | ||
| MCSF supernatant fra 3T3-MCSF celler** | 0.1 | ||
| Natriumpyruvat | 11 mg/ml | ||
| Lysis Buffer. Opbevares ved 4 C. | |||
| 2-mercaptoethanol (tilsættes umiddelbart før brug) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 mM | ||
| Tris | 20 mM | ||
| Triton-X 100 | 0.005 | ||
| **3T3-MCSF-celler dyrkes i DMEM + 10% FCS. Supernatent med MCSF høstes på den 5. dag efter at have nået 100% sammenløb. Som et alternativ kan 10ng/ml rekombinant MCSF anvendes i stedet for konditionerede medier | |||
Tabel 3: Mediets sammensætning og buffere.
Supplerende fil 1: Rå sekventeringsfil til ROSA_ Mock Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Rå sekventeringsfil til ROSA_TargettingGuide Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Rå sekventeringsfil til ScrambleGuide Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Rå sekventeringsfil til SrcG5+SrcG6 Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: Rå sekventeringsfil til CBLB_Mock Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: Rå sekventeringsfil til CBLB_TargetingGuide Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 7: Rå sekventeringsfil til Mock_Guide2Locus Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 8: Rå sekventeringsfil til Mock_Guide6Locus Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 9: Rå sekventeringsfil til SrcGuide2_Enhancer Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 10: Rå sekventeringsfil til SrcGuide2_NoEnhance Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 11: Rå sekventeringsfil til SrcGuide6_Enhancer Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 12: Rå sekventeringsfil til SrcGuide6_NoEnhancer Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genomredigering ved hjælp af elektroporerede Cas9-sgRNA-komplekser muliggør effektiv forstyrrelse af genfunktionen i BMDM'er. Redigeringseffektiviteten varierer efter målsekvens og gen. Typisk screenes fire til fem sgRNA'er generelt for at identificere en, der er meget aktiv. Nogle loci har lavere redigeringseffektivitet, sandsynligvis på grund af kromatinstrukturen. I disse tilfælde kan der foretages flere ændringer for at øge redigeringseffektiviteten. Samtidig levering af to aktive sgRNA'er til samme exon resulterer i forbedret redigering for nogle gener. Men når to guider transfekteres sammen, har vi observeret, at TIDE kan miste nøjagtighed. Derfor kan alternative teknikker til vurdering af redigering, såsom Western blotting, være påkrævet. Derudover øger inkluderingen af en kommercielt tilgængelig NHEJ-forstærker ofte redigeringseffektiviteten med ~ 20% (figur 3).
Denne tilgang har flere fordele. Den direkte levering af sgRNA-Cas9 til celler kræver ikke de tidskrævende trin i plasmidkonstruktion eller lentiviral vektorproduktion for at transducere BMDM'er. Processen med syntetisering af sgRNA, elektroporation og generering af mutantceller kan afsluttes på 1 uge. Denne teknik kan også bruges med BMDM'er afledt af genetisk modificerede mus til at skabe dobbeltmutante celler. Selvom der findes kemiske metoder til transfektering af primære immunceller med siRNA eller mRNA17, er disse kemiske metoder signifikant mindre effektive end elektroporation til at levere Cas9-sgRNA-komplekser til immunceller18. Der er flere typer elektroporationsanordninger tilgængelige kommercielt. Disse enheder forventes at fungere på samme måde til levering af Cas9-sgRNA-komplekser, selvom spændingsparametrene sandsynligvis skal optimeres for hver enkelt enhed. Mens denne protokol primært er blevet brugt på mus BMDM'er, er der i begrænsede eksperimenter opnået lignende resultater med rotte-BMDM'er (upublicerede data). Det er muligt, at andre typer primære makrofager, såsom peritoneale makrofager med mus eller alveolære makrofager, også kan være modtagelige for denne tilgang, selvom dette endnu ikke er blevet testet.
Denne metode har nogle begrænsninger. Antallet af celler produceret af denne protokol er noget begrænset; Vores standardbetingelser genererer 4 x 105 celler pr. Elektroporation. Det kan dog være muligt at opskalere udbyttet betydeligt, da effektiviteten er uformindsket i en 10 μL reaktion med op til 2,4 x 106 celler ved hjælp af samme mængde RNP (upublicerede data). Derudover er 100 μL elektroporationsspidser tilgængelige. En anden ulempe ved denne metode er udgiften; Omkostningerne ved både elektroporatoren og elektroporationsforbrugsstofferne er betydelige. Disse udgifter kan reduceres betydeligt ved at genbruge spidserne, når der anvendes forskellige sgRNA'er rettet mod det samme gen og ved at bruge PBS i stedet for de proprietære buffere. Mens sammensætningen af de proprietære buffere ikke er kendt, tilnærmer elektrolytsammensætningen af PBS med 0,9 mMCaCl2 og 0,5 mMMgCl2 formodentlig den proprietære buffers elektriske ledningsevne. Disse ændringer reducerer omkostningerne ved forbrugsstoffer med ca. 80% i denne protokol.
Der er flere kritiske trin i protokollen, hvis afvigelser dramatisk kan påvirke effektiviteten af genredigeringen. En af de potentielle faldgruber er, at standard IVT-sæt, der ikke er designet til høje udbytter, ofte producerer utilstrækkeligt IVT-produkt. Derudover kan brugen af standard polypropylenmikrofugerør i stedet for lavbindende rør forårsage betydeligt celletab ved vedhæftning. Den ufuldstændige dephosphorylering af IVT-produktet og tilstedeværelsen af resterende DNA i sgRNA-præparatet kan resultere i aktivering af makrofagimmunsensorer og efterfølgende toksicitet. Højere eller længere spændingsimpulser kan også resultere i øget celledød.
Sammenfattende er denne genomredigeringsprotokol, der bruger elektroporation til at levere Cas9-sgRNA RNP'er, en effektiv metode til at forstyrre gener i muse-BMDM'er. Dette giver brugerne mulighed for hurtigt at screene for fænotyper i primære celler, der nærmere rekapitulerer makrofagernes komplekse biologi in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH-tilskuddet 5R01AI144149. De skematiske figurer blev oprettet med BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
