Neutrofila extracellulära fällor (NET) är förknippade med olika sjukdomar, och immunofluorescens används ofta för att visualisera dem. Det finns dock olika färgningsprotokoll, och i många fall undersöks endast en typ av vävnad. Här etablerar vi ett allmänt tillämpligt protokoll för färgning av NET i mus- och mänsklig vävnad.
Neutrofila extracellulära fällor (NET) frigörs av neutrofiler som svar på bakterieinfektion eller traumatisk vävnadsskada, men spelar också en roll vid autoimmuna sjukdomar och steril inflammation. De är nätliknande strukturer som består av dubbelsträngade DNA-filament, histoner och antimikrobiella proteiner. När NET väl har släppts ut kan de fånga och döda extracellulära patogener i blod och vävnad. Dessutom deltar NET i homeostatisk reglering genom att stimulera trombocytadhesion och koagulation. Men den dysreglerade produktionen av NET har också förknippats med olika sjukdomar, inklusive sepsis eller autoimmuna sjukdomar, vilket gör dem till ett lovande mål för terapeutisk intervention. Förutom elektronmikroskopi är visualisering av NET med hjälp av immunofluorescensavbildning för närvarande en av de enda kända metoderna för att påvisa NET-interaktioner i vävnad. Därför har olika färgningsmetoder för att visualisera NET använts. I litteraturen beskrivs olika färgningsprotokoll, och vi identifierade fyra nyckelkomponenter som visar hög variabilitet mellan protokollen: (1) de typer av antikroppar som används, (2) användningen av autofluorescensreducerande medel, (3) antigenhämtningsmetoder och (4) permeabilisering. Därför har in vitro immunofluorescensfärgningsprotokoll systematiskt anpassats och förbättrats i detta arbete för att göra dem tillämpliga för olika arter (mus, människa) och vävnader (hud, tarm, lunga, lever, hjärta, ryggskiva). Efter fixering och paraffininbäddning monterades 3 μm tjocka sektioner på objektglas. Dessa prover färgades med primära antikroppar för myeloperoxidas (MPO), citrullinerad histon H3 (H3cit) och neutrofil elastas (NE) enligt ett modifierat färgningsprotokoll. Objektglasen färgades med sekundära antikroppar och undersöktes med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Resultaten analyserades enligt ett utvärderingsformulär och skillnader registrerades semikvantitativt.
Här presenterar vi ett optimerat NET-färgningsprotokoll som lämpar sig för olika vävnader. Vi använde en ny primär antikropp för att färga för H3cit och minskade ospecifik färgning med ett autofluorescensreducerande medel. Vidare visade vi att NET-färgning kräver en konstant hög temperatur och noggrann hantering av prover.
Neutrofila extracellulära fällor (NET) visualiserades först av Brinkmann et al. som en väg för celldöd som skiljer sig från apoptos och nekros 20041. I denna väg släpper neutrofiler ut sitt dekondenserade kromatin i det extracellulära utrymmet för att bilda stora nätliknande strukturer täckta av antimikrobiella proteiner som tidigare lagrades i granulerna eller cytosolen. Dessa antimikrobiella proteiner inkluderar neutrofilt elastas (NE), myeloperoxidas (MPO) och citrullinerad histon H3 (H3cit), som vanligtvis används för indirekt immunofluorescensdetektion av NET2. Denna metod identifierar inte bara den kvantitativa närvaron av dessa proteiner; Det har faktiskt fördelen att det specifikt detekterar NET-liknande strukturer. I NET samlokaliseras de nämnda proteinerna med extracellulärt DNA, vilket kan detekteras genom en överlappning av fluorescenssignalerna för varje färgat protein och det extracellulära DNA:t. Till skillnad från de överlappande signalerna på grund av extracellulärt DNA och proteinsamlokalisering i NET, visar intakta neutrofiler ingen samlokalisering. Här lagras NET-komponenterna vanligtvis separat i granuler, kärnor och cytosol3.
Sedan den första upptäckten har det visat sig att NET spelar en central roll i många sjukdomar, särskilt de som involverar inflammation. NET visar antimikrobiella funktioner under infektion genom att fånga och döda extracellulära patogener i blod och vävnad 4,5. Men NET har också kopplats till autoimmuna sjukdomar och hyperinflammatoriska svar, som systemisk lupus erythematosus, reumatisk artrit och allergisk astma 6,7,8. NET främjar vasoocklusion och inflammation vid åderförkalkning, trombocytvidhäftning och spekuleras spela en roll i metastaserande cancer 9,10,11. Ändå tros de ha antiinflammatoriska egenskaper genom att minska proinflammatoriska cytokinnivåer12. Även om NET blir allt mer intressant inom ett bredare forskningsområde, är en robust NET-detektionsmetod grundläggande för framtida forskning.
Även om visualisering av NET i olika vävnader med hjälp av immunofluorescensavbildning är komplex och kräver anpassning, förutom elektronmikroskopi, är det för närvarande en av de mest kända metoderna för att visualisera interaktionerna mellan NET och celler och används främst i formalinfixerade paraffininbäddade vävnader (FFPE)13,14. Det är dock svårt att jämföra NET-avbildning, eftersom olika laboratorier använder sina egna anpassade protokoll. Dessa protokoll skiljer sig åt i sin användning av antikroppar, antigenhämtning eller permeabiliseringsmetod och är ofta optimerade för en specifik typ av vävnad 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
Efter att Brinkmann et al. publicerade den första metodiska studien med immunofluorescensvisualisering av NET i FFPE-vävnad, ville vi optimera detta protokoll för en bredare variation av vävnader och arter15. Dessutom, för att etablera ett brett tillämpligt immunofluorescensprotokoll, testade vi olika modifierade protokoll från studier som använde immunfluorescensmetoder i FFPE-vävnad för att detektera NET 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Dessutom provade vi en ny H3cit-antikropp för mer specifik extracellulär färgning28. Vår hypotes är att genom att systematiskt anpassa nuvarande färgningsprotokoll till olika arter och vävnader kan in vitro-avbildning förbättras, vilket resulterar i en bättre representation av interaktionen mellan neutrofiler och NET både lokalt och systemiskt.
I detta arbete syftade vi till att anpassa och optimera de befintliga protokollen för avbildning av NET till fler vävnadstyper, med början i själva färgningsprocessen. Det första kritiska steget för denna metod är valet av de mest lämpliga antikropparna. För NE provade vi en NE-antikropp från en musvärd på mänsklig vävnad, som inte visade någon tillförlitlig färgning jämfört med NE från en kaninvärd. Vidare föreslog Thålin et al. H3cit (R8) som en mer specifik antikropp för extracellulär färgni…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning grundades av det tyska forskningssällskapet (BO5534). Vi tackar Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer och PD Dr. Ingo Königs för att de försett oss med prover. Dessutom tackar författarna teamet vid UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) för stöd med immunofluorescensmikroskopin.
Dilution | |||
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody 100µg | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
Axiovision Microscopy Software | Zeiss | 4.8.2. | |
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml | GeneTex | GTX30972 | |
Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
DCS antibody dilution 500 mL | DCS diagnostics | DCS AL120R500 | |
Donkey ant goat Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
Donkey anti rabbit AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
Donkey anti rabbit Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
Fluoromount-G Mounting Medium | Invitrogen | 00-4958-02 | |
Glass slide rack | Roth | H552.1 | |
Human/Mouse MPO Antibody | R&D Systems | AF 3667 | 1:20 |
Hydrophobic Pen | KISKER | MKP-1 | |
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 and 1:250 |
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
Microscopy camera | Zeiss | AxioCamHR3 | |
Microwave | Bosch | HMT84M421 | |
Mouse IgG1 negative control | Dako | X0931 Aglient | 1:50 and 1:5 |
Normal Goat IgG Control | R&D Systems | AB-108-C | 1:100 |
PBS Phosphate buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
PMP staining jar | Roth | 2292.2 | |
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
ROTI Histol | Roth | 6640 | |
SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
TBS Tris buffered saline (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Water bath | Memmert | 830476 | |
Water bath rice cooker | reishunger | RCP-30 | |
Wet chamber | Weckert Labortechnik | 600016 | |
Zeiss Widefield microscope | Zeiss | Axiovert 200M |