मानव और माउस ऊतकों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग
Summary
न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) विभिन्न बीमारियों से जुड़े होते हैं, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग अक्सर उनके विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया जाता है। हालांकि, विभिन्न धुंधला प्रोटोकॉल हैं, और, कई मामलों में, केवल एक प्रकार के ऊतक की जांच की जाती है। यहां, हम माउस और मानव ऊतक में एनईटी को धुंधला करने के लिए आम तौर पर लागू प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं।
Abstract
न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) बैक्टीरिया के संक्रमण या दर्दनाक ऊतक क्षति की प्रतिक्रिया के रूप में न्यूट्रोफिल द्वारा जारी किए जाते हैं, लेकिन ऑटोइम्यून बीमारियों और बाँझ सूजन में भी भूमिका निभाते हैं। वे डबल-फंसे हुए डीएनए फिलामेंट्स, हिस्टोन और रोगाणुरोधी प्रोटीन से बने वेब जैसी संरचनाएं हैं। एक बार जारी होने के बाद, एनईटी रक्त और ऊतक में बाह्य रोगजनकों को फंसा और मार सकता है। इसके अलावा, एनईटी प्लेटलेट आसंजन और जमावट को उत्तेजित करके होमियोस्टैटिक विनियमन में भाग लेते हैं। हालांकि, एनईटी का अनियमित उत्पादन सेप्सिस या ऑटोइम्यून विकारों सहित विभिन्न बीमारियों से भी जुड़ा हुआ है, जो उन्हें चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक आशाजनक लक्ष्य बनाता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके एनईटी की कल्पना करना वर्तमान में ऊतक में नेट इंटरैक्शन को प्रदर्शित करने के लिए एकमात्र ज्ञात तरीकों में से एक है। इसलिए, एनईटी की कल्पना करने के लिए विभिन्न धुंधला तरीकों का उपयोग किया गया है। साहित्य में, विभिन्न धुंधला प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, और हमने प्रोटोकॉल के बीच उच्च परिवर्तनशीलता दिखाने वाले चार प्रमुख घटकों की पहचान की: (1) उपयोग किए गए एंटीबॉडी के प्रकार, (2) ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंटों का उपयोग, (3) एंटीजन पुनर्प्राप्ति विधियां, और (4) परमेबिलाइजेशन। इसलिए, इन विट्रो इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रजातियों (माउस, मानव) और ऊतकों (त्वचा, आंत, फेफड़े, यकृत, हृदय, रीढ़ की हड्डी की डिस्क) के लिए लागू करने के लिए इस काम में व्यवस्थित रूप से अनुकूलित और सुधार किया गया था। निर्धारण और पैराफिन-एम्बेडिंग के बाद, 3 μm मोटे वर्गों को स्लाइड पर लगाया गया था। इन नमूनों को एक संशोधित धुंधला प्रोटोकॉल के अनुसार मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ), सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 (एच 3 सिट), और न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी से दाग दिया गया था। स्लाइड्स को द्वितीयक एंटीबॉडी से दाग दिया गया था और वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जांच की गई थी। परिणामों का विश्लेषण एक मूल्यांकन शीट के अनुसार किया गया था, और अंतर अर्ध-मात्रात्मक रूप से दर्ज किए गए थे।
यहां, हम विभिन्न ऊतकों के लिए उपयुक्त एक अनुकूलित नेट स्टेनिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमने एच 3 सीआईटी के लिए दाग लगाने के लिए एक नए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया और ऑटोफ्लोरेसेंस-कम करने वाले एजेंट के साथ गैर-विशिष्ट धुंधलापन कम कर दिया। इसके अलावा, हमने दिखाया कि नेट धुंधला होने के लिए निरंतर उच्च तापमान और नमूनों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है।
Introduction
न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) को पहली बार ब्रिंकमैन एट अल द्वारा 2004 में एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस से अलग सेलुलर मृत्यु के मार्ग के रूप में देखा गयाथा। इस मार्ग में, न्यूट्रोफिल अपने डीकन्डेन्स्ड क्रोमैटिन को बाह्य अंतरिक्ष में छोड़ते हैं ताकि रोगाणुरोधी प्रोटीन में कवर की गई बड़ी वेब जैसी संरचनाएं बनाई जा सकें जो पहले कणिकाओं या साइटोसोल में संग्रहीत थीं। इन रोगाणुरोधी प्रोटीन ों में न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई), मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ), और सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 (एच 3 सीआईटी) शामिल हैं, जो आमतौर पर एनईटी2 के अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाते हैं। यह विधि न केवल इन प्रोटीनों की मात्रात्मक उपस्थिति की पहचान करती है; वास्तव में, इसमें विशेष रूप से नेट जैसी संरचनाओं का पता लगाने का लाभ है। एनईटी में, उल्लिखित प्रोटीन बाह्य डीएनए के साथ सह-स्थानीयकरण करते हैं, जिसे प्रत्येक दाग वाले प्रोटीन और बाह्य डीएनए के प्रतिदीप्ति संकेतों के ओवरलैप द्वारा पता लगाया जा सकता है। एनईटी में बाह्य डीएनए और प्रोटीन सह-स्थानीयकरण के कारण अतिव्यापी संकेतों के विपरीत, बरकरार न्यूट्रोफिल कोई सह-स्थानीयकरण नहीं दिखाते हैं। यहां, नेट घटक ों को आमतौर पर कणिकाओं, नाभिक और साइटोसोल3 में अलग से संग्रहीत किया जाता है।
उनकी पहली खोज के बाद से, यह दिखाया गया है कि एनईटी कई बीमारियों में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से सूजन से जुड़े। एनईटी रक्त और ऊतक 4,5 में बाह्य रोगजनकों को फंसाने और मारने के माध्यम से संक्रमण के दौरान रोगाणुरोधी कार्य दिखाते हैं। हालांकि, एनईटी को ऑटोइम्यून बीमारियों और हाइपरइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं से भी जोड़ा गया है, जैसे प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस, आमवाती गठिया, और एलर्जी अस्थमा 6,7,8। एनईटी एथेरोस्क्लेरोसिस, प्लेटलेट आसंजन में वासो-रोड़ा और सूजन को बढ़ावा देते हैं, और मेटास्टैटिक कैंसर 9,10,11 में भूमिका निभाने का अनुमान लगाया जाता है। फिर भी, उन्हें प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन के स्तरको कम करके विरोधी भड़काऊ गुण माना जाता है। जबकि एनईटी अनुसंधान के व्यापक क्षेत्र में अधिक रुचि प्राप्त कर रहे हैं, भविष्य के अनुसंधान के लिए एक मजबूत नेट डिटेक्शन विधि मौलिक है।
भले ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके विभिन्न ऊतकों में एनईटी का विज़ुअलाइज़ेशन जटिल है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के अलावा अनुकूलन की आवश्यकता होती है, यह वर्तमान में एनईटी और कोशिकाओं के बीच बातचीत को देखने के लिए सबसे प्रसिद्ध तरीकों में से एक है और मुख्य रूप से फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों (एफएफपीई) 13,14 में उपयोग किया जाता है।. हालांकि, नेट इमेजिंग की तुलना करना मुश्किल है, क्योंकि विभिन्न प्रयोगशालाएं अपने स्वयं के अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करती हैं। ये प्रोटोकॉल एंटीबॉडी, एंटीजन पुनर्प्राप्ति, या परमेबिलाइजेशन विधि के उनके उपयोग में भिन्न होते हैं और अक्सर एक विशिष्ट प्रकार के ऊतक 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 के लिए अनुकूलित होते हैं।, 27.
ब्रिंकमैन एट अल ने एफएफपीई ऊतक में एनईटी के इम्यूनोफ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग करके पहला मेथोडिक अध्ययन प्रकाशित करने के बाद, हम इस प्रोटोकॉल को ऊतकों और प्रजातियोंकी एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित करना चाहते थे। इसके अतिरिक्त, एक व्यापक रूप से लागू इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए, हमने अध्ययनों से विभिन्न संशोधित प्रोटोकॉल का परीक्षण किया, जिन्होंने एनईटी 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 का पता लगाने के लिए एफएफपीई ऊतक में इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधियों का उपयोग किया। 26,27. इसके अलावा, हमने अधिक विशिष्ट बाह्य धुंधला28 के लिए एक नए एच 3 सीआईटी एंटीबॉडी की कोशिश की। हम अनुमान लगाते हैं कि विभिन्न प्रजातियों और ऊतकों के लिए वर्तमान धुंधला प्रोटोकॉल को व्यवस्थित रूप से अनुकूलित करके, इन विट्रो इमेजिंग में सुधार किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय और व्यवस्थित रूप से न्यूट्रोफिल और एनईटी के बीच बातचीत का बेहतर प्रतिनिधित्व होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में, हमने वास्तविक धुंधला प्रक्रिया से शुरू होने वाले अधिक ऊतक प्रकारों के लिए इमेजिंग एनईटी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल को अनुकूलित और अनुकूलित करने का लक्ष्य रखा। इस विधि के लिए पहला महत्वपूर्ण क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध की स्थापना जर्मन रिसर्च सोसाइटी (बीओ 5534) द्वारा की गई थी। हम एंटोनिया किविट, मोरिट्ज़ लेनज़, जोहाना हेगेंस, डॉ अन्निका ह्यूर, और पीडी डॉ इंगो कोनिग्स को हमें नमूने प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इसके अतिरिक्त, लेखक इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ समर्थन के लिए यूकेई माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा (कोर सुविधा, यूकेई मेडिकल स्कूल) की टीम को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Dilution | |||
| Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody 100µg | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Axiovision Microscopy Software | Zeiss | 4.8.2. | |
| Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml | GeneTex | GTX30972 | |
| Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS antibody dilution 500 mL | DCS diagnostics | DCS AL120R500 | |
| Donkey ant goat Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Glass slide rack | Roth | H552.1 | |
| Human/Mouse MPO Antibody | R&D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| Hydrophobic Pen | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 and 1:250 |
| MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
| Microscopy camera | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Microwave | Bosch | HMT84M421 | |
| Mouse IgG1 negative control | Dako | X0931 Aglient | 1:50 and 1:5 |
| Normal Goat IgG Control | R&D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS Phosphate buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP staining jar | Roth | 2292.2 | |
| Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris buffered saline (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Water bath | Memmert | 830476 | |
| Water bath rice cooker | reishunger | RCP-30 | |
| Wet chamber | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss Widefield microscope | Zeiss | Axiovert 200M |
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