Dissektion og isolering af regionsspecifikt decellulariseret lungevæv

Summary

Præsenteret her er en protokol til isolering af regionalt decellulariseret lungevæv. Denne protokol giver et kraftfuldt værktøj til at studere kompleksiteter i de ekstracellulære matrix- og cellematrixinteraktioner.

Abstract

Lungetransplantation er ofte den eneste mulighed for patienter i de senere stadier af svær lungesygdom, men dette er begrænset både på grund af udbuddet af egnede donorlunger og både akut og kronisk afstødning efter transplantation. Konstatering af nye bioteknologiske tilgange til udskiftning af syge lunger er afgørende for at forbedre patientens overlevelse og undgå komplikationer forbundet med nuværende transplantationsmetoder. En alternativ tilgang indebærer anvendelse af decellulariserede hele lunger, der mangler cellulære bestanddele, der typisk er årsagen til akut og kronisk afstødning. Da lungen er et så komplekst organ, er det af interesse at undersøge de ekstracellulære matrixkomponenter i specifikke regioner, herunder vaskulatur, luftveje og alveolært væv. Formålet med denne tilgang er at etablere enkle og reproducerbare metoder, hvormed forskere kan dissekere og isolere regionsspecifikt væv fra fuldt decellulariserede lunger. Den nuværende protokol er udarbejdet for griselunger og menneskelige lunger, men kan også anvendes på andre arter. For denne protokol blev fire regioner af vævet specificeret: luftveje, vaskulatur, alveoler og bulk lungevæv. Denne procedure giver mulighed for udtagning af prøver af væv, der mere præcist repræsenterer indholdet af det decellulariserede lungevæv i modsætning til traditionelle bulkanalysemetoder.

Introduction

Lungesygdomme, herunder kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), idiopatisk lungefibrose (IPF) og cystisk fibrose (CF), forbliver i øjeblikket uden kur 1,2,3,4. Lungetransplantation er ofte den eneste mulighed for patienter i senere stadier, men dette er fortsat en begrænset mulighed både på grund af udbuddet af egnede donorlunger og både akut og kronisk afstødning efter transplantation ^3,5,6. Som sådan er der et kritisk behov for nye behandlingsstrategier. En lovende tilgang inden for respiratorisk bioteknologi er anvendelsen af vævsafledte stilladser fremstillet af decellulariseret indfødt lungevæv. Da acellulære hele lungestilladser bevarer meget af kompleksiteten af den oprindelige ekstracellulære matrix (ECM) sammensætning og bioaktivitet, er de blevet intensivt undersøgt for helorganteknik og som forbedrede modeller til undersøgelse af lungesygdomsmekanismer 7,8,9,10. Parallelt er der stigende interesse for at udnytte decellulariserede væv fra forskellige organer, herunder lunger, som hydrogeler og andre substrater til undersøgelse af celle-celle- og celle-ECM-interaktioner i organoid- og andre vævskulturmodeller 11,12,13,14,15,16,17 . Disse giver mere relevante modeller end kommercielt tilgængelige substrater, såsom Matrigel, afledt af tumorkilder. Imidlertid er oplysninger om humane lungeafledte hydrogeler relativt begrænsede på nuværende tidspunkt. Vi har tidligere beskrevet hydrogeler afledt af decellulariserede svinelunger og har karakteriseret både deres mekaniske og materielle egenskaber, samt demonstreret deres anvendelighed som cellekulturmodeller^18,19. En nylig rapport detaljerede den indledende mekaniske og viskoelastiske karakterisering af hydrogeler afledt af decellulariserede normale og syge (KOL, IPF) menneskelige lunger²⁰. Vi har også præsenteret indledende data, der karakteriserer glycosaminoglycanindholdet i decellulariserede normale og KOL menneskelige lunger, samt deres anvendelighed til undersøgelse af celle-celle og celle-ECM-interaktioner¹¹.

Disse eksempler illustrerer kraften i at bruge decellulariserede humane lunge-ECM’er til undersøgelsesformål. Lungen er imidlertid et komplekst organ, og både struktur og funktion varierer i forskellige områder af lungen, herunder ECM-sammensætning og andre egenskaber såsom stivhed^21,22. Som sådan er det af interesse at studere ECM i individuelle lungeområder, herunder luftrøret og store luftveje, mellemstore og små luftveje og alveoler samt store, mellemstore og små blodkar. Til dette formål har vi udviklet en pålidelig og reproducerbar metode til at dissekere decellulariserede menneske- og svinelunger og efterfølgende isolere hver af disse anatomiske regioner. Dette har muliggjort detaljeret differentiel analyse af regionalt proteinindhold i både normale og syge lunger²¹.

Protocol

Alle dyreforsøg er udført i overensstemmelse med IACUC fra University of Vermont (UVM). Alle menneskelige lunger blev erhvervet fra UVM Autopsy Services, og relaterede undersøgelser blev udført i henhold til retningslinjerne for IRB af UVM. BEMÆRK: Decellularisering af grise- og humane lunger er tidligere beskrevet af vores gruppe 7,8,9,10,21.<sup cla…

Representative Results

Et overordnet skema over protokollen er afbildet i figur 1. Når den er mestret, er den regionale dissektion af decellulariseret lungevæv let reproducerbar. Bestemmelse af kategoriseringen af hver afskåret vævsprøve er afgørende for dissektionsprocedurens succes. Vaskulært væv er væsentligt mere elastisk end luftvejene, så brug af tang til at strække vævet er ofte en stærk indikator for, om en bestemt prøve er vaskulatur eller luftvej. Typisk løber vaskulært væv parallelt med…

Discussion

Decellulariseret væv fra mennesker og andre arter anvendes ofte som biomaterialer til undersøgelse af ECM-sammensætning samt celle-ECM-interaktioner i ex vivo-kulturmodeller, herunder 3D-hydrogeler^12,13. I lighed med andre organer er decellulariserede lunger tidligere blevet brugt til at bestemme ECM-sammensætningsforskelle i raske versus syge (dvs. emfysematøse og IPF) lunger og bruges i stigende grad som hydrogeler til undersøgelse af ECM-dynamik…

Materials

Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10