Dissecção e Isolamento de Tecido Pulmonar Descelularizado Regional-Específico

Summary

Apresenta-se um protocolo para o isolamento de tecido pulmonar decelularizado regional. Este protocolo fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de complexidades na matriz extracelular e interações célula-matriz.

Abstract

O transplante pulmonar é muitas vezes a única opção para pacientes em estágios mais avançados de doença pulmonar grave, mas isso é limitado tanto devido ao suprimento de pulmões de doadores adequados quanto à rejeição aguda e crônica após o transplante. Determinar novas abordagens de bioengenharia para a substituição de pulmões doentes é imperativo para melhorar a sobrevida dos pacientes e evitar complicações associadas às metodologias atuais de transplante. Uma abordagem alternativa envolve o uso de pulmões inteiros descelularizados sem constituintes celulares que são tipicamente a causa da rejeição aguda e crônica. Como o pulmão é um órgão tão complexo, é de interesse examinar os componentes da matriz extracelular de regiões específicas, incluindo a vasculatura, as vias aéreas e o tecido alveolar. O objetivo dessa abordagem é estabelecer métodos simples e reprodutíveis pelos quais os pesquisadores possam dissecar e isolar tecidos específicos da região de pulmões totalmente decelularizados. O protocolo atual foi desenvolvido para pulmões de suínos e humanos, mas pode ser aplicado a outras espécies também. Para esse protocolo, foram especificadas quatro regiões do tecido: via aérea, vasculatura, alvéolos e tecido pulmonar volumoso. Este procedimento permite a obtenção de amostras de tecido que representam com mais precisão o conteúdo do tecido pulmonar decelularizado, em oposição aos métodos tradicionais de análise em massa.

Introduction

Atualmente, as doenças pulmonares, incluindo a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), a fibrose pulmonar idiopática (FPI) e a fibrose cística (FC), permanecem sem cura 1,2,3,4. O transplante pulmonar é muitas vezes a única opção para pacientes em estágios mais avançados, porém continua sendo uma opção limitada, tanto pelo suprimento de pulmões de doadores adequados quanto pela rejeição aguda e crônica após o transplante ^3,5,6. Como tal, há uma necessidade crítica de novas estratégias de tratamento. Uma abordagem promissora em bioengenharia respiratória é a aplicação de arcabouços derivados de tecidos preparados a partir de tecido pulmonar nativo decelularizado. Como os arcabouços pulmonares acelulares retêm grande parte da complexidade da composição e bioatividade da matriz extracelular nativa (MEC), eles têm sido intensamente estudados para engenharia de órgãos inteiros e como modelos aprimorados para o estudo de mecanismos de doenças pulmonares 7,8,9,10. Paralelamente, há um crescente interesse na utilização de tecidos decelularizados de diferentes órgãos, incluindo pulmões, como hidrogéis e outros substratos para o estudo das interações célula-célula e célula-MEC em modelos de cultura de organoides e outros tecidos 11,12,13,14,15,16,17 . Estes fornecem modelos mais relevantes do que substratos comercialmente disponíveis, como o Matrigel, derivado de fontes tumorais. No entanto, as informações sobre hidrogéis derivados do pulmão humano são relativamente limitadas no momento. Descrevemos previamente hidrogéis derivados de pulmões de porcos decelularizados e caracterizamos suas propriedades mecânicas e materiais, bem como demonstramos sua utilidade como modelos de cultura celular^18,19. Um relato recente detalhou a caracterização mecânica e viscoelástica inicial de hidrogéis derivados de pulmões humanos normais e doentes (DPOC, FPI)^{decelularizados 20}. Também apresentamos dados iniciais caracterizando o conteúdo de glicosaminoglicanos de pulmões humanos normais e DPOC decelularizados, bem como sua aplicabilidade no estudo das interações célula-célula e^{célula-MEC11}.

Esses exemplos ilustram o poder da utilização de ECMs de pulmão humano decelularizado para fins investigativos. No entanto, o pulmão é um órgão complexo, e tanto a estrutura quanto a função variam em diferentes regiões do pulmão, incluindo a composição da MEC e outras propriedades, como a rigidez^21,22. Dessa forma, é de interesse estudar a MEC em regiões individuais do pulmão, incluindo traqueia e grandes vias aéreas, médias e pequenas vias aéreas e alvéolos, bem como grandes, médios e pequenos vasos sanguíneos. Para isso, desenvolvemos um método confiável e reprodutível para dissecar pulmões humanos e suínos descelularizados e, posteriormente, isolar cada uma dessas regiões anatômicas. Isso permitiu uma análise diferencial detalhada do conteúdo proteico regional em pulmões normais e doentes²¹.

Protocol

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com a IACUC da Universidade de Vermont (UVM). Todos os pulmões humanos foram adquiridos dos Serviços de Autópsia da UVM e os estudos relacionados foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB da UVM. NOTA: A decelularização de pulmões de suínos e humanos já foi descrita pelo nosso grupo 7,8,9,10,21….

Representative Results

Um esquema geral do protocolo é mostrado na Figura 1. Uma vez dominada, a dissecção regional do tecido pulmonar decelularizado é facilmente reprodutível. A determinação da categorização de cada amostra de tecido cortado é imprescindível para o sucesso do procedimento de dissecção. O tecido vascular é substancialmente mais elástico do que as vias aéreas, portanto, o uso de pinças para esticar o tecido é frequentemente um forte indicador de se uma determinada amostra é vascu…

Discussion

Tecidos decelularizados de humanos e de outras espécies são frequentemente utilizados como biomateriais para estudar a composição da MEC, bem como interações célula-MEC em modelos de cultura ex vivo, incluindo hidrogéis 3D^12,13. À semelhança de outros órgãos, pulmões descelularizados têm sido previamente utilizados para determinar diferenças na composição da MEC em pulmões saudáveis versus doentes (isto é, enfisematosos e FPI) e estã…

Materials

Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10