Disección y aislamiento de tejido pulmonar descelularizado específico de la región
Summary
Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento del tejido pulmonar descelularizado regional. Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para estudiar las complejidades en la matriz extracelular y las interacciones célula-matriz.
Abstract
El trasplante de pulmón es a menudo la única opción para los pacientes en las últimas etapas de la enfermedad pulmonar grave, pero esto es limitado debido tanto al suministro de pulmones de donantes adecuados como al rechazo agudo y crónico después del trasplante. Determinar nuevos enfoques de bioingeniería para el reemplazo de pulmones enfermos es imperativo para mejorar la supervivencia del paciente y evitar complicaciones asociadas con las metodologías actuales de trasplante. Un enfoque alternativo implica el uso de pulmones enteros descelularizados que carecen de componentes celulares que son típicamente la causa del rechazo agudo y crónico. Dado que el pulmón es un órgano tan complejo, es interesante examinar los componentes de la matriz extracelular de regiones específicas, incluida la vasculatura, las vías respiratorias y el tejido alveolar. El propósito de este enfoque es establecer métodos simples y reproducibles mediante los cuales los investigadores pueden diseccionar y aislar tejido específico de la región de pulmones completamente descelularizados. El protocolo actual ha sido diseñado para pulmones de cerdo y humanos, pero también puede aplicarse a otras especies. Para este protocolo, se especificaron cuatro regiones del tejido: vía aérea, vasculatura, alvéolos y tejido pulmonar a granel. Este procedimiento permite la obtención de muestras de tejido que representan con mayor precisión el contenido del tejido pulmonar descelularizado en comparación con los métodos tradicionales de análisis a granel.
Introduction
Las enfermedades pulmonares, incluyendo la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) y la fibrosis quística (FQ), actualmente permanecen sin cura 1,2,3,4. El trasplante pulmonar es a menudo la única opción para los pacientes en etapas posteriores, sin embargo, esta sigue siendo una opción limitada debido al suministro de pulmones de donantes adecuados y al rechazo agudo y crónico después del trasplante 3,5,6. Como tal, existe una necesidad crítica de nuevas estrategias de tratamiento. Un enfoque prometedor en bioingeniería respiratoria es la aplicación de andamios derivados de tejidos preparados a partir de tejido pulmonar nativo descelularizado. Como los andamios pulmonares completos acelulares conservan gran parte de la complejidad de la composición y bioactividad de la matriz extracelular nativa (MEC), se han estudiado intensamente para la ingeniería de órganos completos y como modelos mejorados para estudiar los mecanismos de la enfermedad pulmonar 7,8,9,10. Paralelamente, existe un creciente interés en utilizar tejidos descelularizados de diferentes órganos, incluidos los pulmones, como hidrogeles y otros sustratos para estudiar las interacciones célula-célula y célula-ECM en organoides y otros modelos de cultivo de tejidos 11,12,13,14,15,16,17 . Estos proporcionan modelos más relevantes que los sustratos disponibles comercialmente, como Matrigel, derivados de fuentes tumorales. Sin embargo, la información sobre los hidrogeles derivados de pulmón humano es relativamente limitada en la actualidad. Hemos descrito previamente hidrogeles derivados de pulmones de cerdo descelularizados y hemos caracterizado tanto sus propiedades mecánicas como materiales, así como demostrado su utilidad como modelos de cultivo celular18,19. Un informe reciente detalló la caracterización mecánica y viscoelástica inicial de hidrogeles derivados de pulmones humanos normales y enfermos descelularizados (EPOC, FPI)20. También hemos presentado datos iniciales que caracterizan el contenido de glicosaminoglicanos de pulmones humanos normales y EPOC descelularizados, así como su aplicabilidad para el estudio de las interacciones célula-célula y célula-MEC11.
Estos ejemplos ilustran el poder de utilizar ECM de pulmón humano descelularizado con fines de investigación. Sin embargo, el pulmón es un órgano complejo, y tanto la estructura como la función varían en diferentes regiones del pulmón, incluyendo la composición de la ECM y otras propiedades como la rigidez21,22. Como tal, es de interés estudiar la ECM en regiones individuales del pulmón, incluyendo la tráquea y las vías respiratorias grandes, las vías respiratorias medianas y pequeñas, y los alvéolos, así como los vasos sanguíneos grandes, medianos y pequeños. Con este fin, hemos desarrollado un método confiable y reproducible para diseccionar pulmones humanos y porcinos descelularizados y posteriormente aislar cada una de esas regiones anatómicas. Esto ha permitido un análisis diferencial detallado del contenido de proteínas regionales tanto en pulmones normales como enfermos21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los tejidos descelularizados de humanos y otras especies se utilizan con frecuencia como biomateriales para estudiar la composición de la ECM, así como las interacciones célula-MEC en modelos de cultivo ex vivo, incluidos los hidrogeles 3D12,13. Al igual que otros órganos, los pulmones descelularizados se han utilizado previamente para determinar las diferencias de composición de la ECM en pulmones sanos versus enfermos (es decir, enfisematosos e IP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los servicios de autopsia de UVM para la obtención de pulmón humano y a Robert Pouliot PhD por sus contribuciones a las técnicas generales de disección. Estos estudios fueron apoyados por R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
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