Dissektion och isolering av regionspecifik decellulariserad lungvävnad
Summary
Här presenteras ett protokoll för isolering av regional decellulariserad lungvävnad. Detta protokoll ger ett kraftfullt verktyg för att studera komplexiteter i extracellulär matris och cell-matrisinteraktioner.
Abstract
Lungtransplantation är ofta det enda alternativet för patienter i de senare stadierna av svår lungsjukdom, men detta är begränsat både på grund av tillgången på lämpliga donatorlungor och både akut och kronisk avstötning efter transplantation. Att fastställa nya biotekniska metoder för ersättning av sjuka lungor är absolut nödvändigt för att förbättra patienternas överlevnad och undvika komplikationer i samband med nuvarande transplantationsmetoder. Ett alternativt tillvägagångssätt innebär användning av decellulariserade hela lungor som saknar cellulära beståndsdelar som vanligtvis är orsaken till akut och kronisk avstötning. Eftersom lungan är ett så komplext organ är det av intresse att undersöka de extracellulära matriskomponenterna i specifika regioner, inklusive vaskulatur, luftvägar och alveolär vävnad. Syftet med detta tillvägagångssätt är att etablera enkla och reproducerbara metoder genom vilka forskare kan dissekera och isolera regionspecifik vävnad från helt decellulariserade lungor. Det nuvarande protokollet har utformats för gris och mänskliga lungor, men kan också tillämpas på andra arter. För detta protokoll specificerades fyra regioner av vävnaden: luftväg, vaskulatur, alveoler och bulklungvävnad. Denna procedur möjliggör upphandling av vävnadsprover som mer exakt representerar innehållet i den decellulariserade lungvävnaden i motsats till traditionella bulkanalysmetoder.
Introduction
Lungsjukdomar, inklusive kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), idiopatisk lungfibros (IPF) och cystisk fibros (CF), förblir för närvarande utan botemedel 1,2,3,4. Lungtransplantation är ofta det enda alternativet för patienter i senare skeden, men detta är fortfarande ett begränsat alternativ både på grund av tillgången på lämpliga donatorlungor och både akut och kronisk avstötning efter transplantation 3,5,6. Som sådan finns det ett kritiskt behov av nya behandlingsstrategier. Ett lovande tillvägagångssätt inom respiratorisk bioteknik är tillämpningen av vävnadshärledda byggnadsställningar framställda av decellulariserad inhemsk lungvävnad. Eftersom acellulära hela lungställningar behåller mycket av komplexiteten hos den ursprungliga extracellulära matrissammansättningen (ECM) och bioaktiviteten, har de studerats intensivt för helorganteknik och som förbättrade modeller för att studera lungsjukdomsmekanismer 7,8,9,10. Parallellt finns det ett ökande intresse för att använda decellulariserade vävnader från olika organ, inklusive lungor, som hydrogeler och andra substrat för att studera cell-cell och cell-ECM-interaktioner i organoid- och andra vävnadsodlingsmodeller 11,12,13,14,15,16,17 . Dessa ger mer relevanta modeller än kommersiellt tillgängliga substrat, såsom Matrigel, härrörande från tumörkällor. Informationen om humana lung-härledda hydrogeler är dock relativt begränsad för närvarande. Vi har tidigare beskrivit hydrogeler härrörande från decellulariserade grislungor och har karakteriserat både deras mekaniska och materialegenskaper, samt demonstrerat deras användbarhet som cellodlingsmodeller18,19. En ny rapport detaljerade den initiala mekaniska och viskoelastiska karakteriseringen av hydrogeler härrörande från decellulariserade normala och sjuka (KOL, IPF) mänskliga lungor20. Vi har också presenterat initiala data som karakteriserar glykosaminoglykaninnehållet i decellulariserade normala och KOL-humana lungor, samt deras tillämplighet för att studera cell-cell och cell-ECM-interaktioner11.
Dessa exempel illustrerar kraften i att använda decellulariserade humana lung-ECM för utredningsändamål. Lungan är dock ett komplext organ, och både struktur och funktion varierar i olika regioner i lungan, inklusive ECM-sammansättning och andra egenskaper som styvhet21,22. Som sådan är det av intresse att studera ECM i enskilda regioner i lungan, inklusive luftstrupen och stora luftvägar, medelstora och små luftvägar och alveoler, liksom stora, medelstora och små blodkärl. För detta ändamål har vi utvecklat en pålitlig och reproducerbar metod för dissekering av decellulariserade humana lungor och grislungor och därefter isolera var och en av dessa anatomiska regioner. Detta har möjliggjort detaljerad differentialanalys av regionalt proteininnehåll i både normala och sjuka lungor21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Decellulariserade vävnader från människor och andra arter används ofta som biomaterial för att studera ECM-sammansättning såväl som cell-ECM-interaktioner i ex vivo-odlingsmodeller, inklusive 3D-hydrogeler12,13. I likhet med andra organ har decellulariserade lungor tidigare använts för att bestämma ECM-sammansättningsskillnader i friska kontra sjuka (dvs. emfysematösa och IPF) lungor och används alltmer som hydrogeler för att studera ECM-d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar UVM-obduktionstjänsterna för mänsklig lungupphandling och Robert Pouliot PhD för bidrag till de övergripande dissektionsteknikerna. Dessa studier stöddes av R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. Global burden of COPD. Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).
- Raherison, C., Girodet, P. -. O. Epidemiology of COPD. European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M. Cystic Fibrosis. Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F. The future of lung transplantation. Chest. 155 (3), 465-473 (2019).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
