Disseksjon og isolering av regionspesifikt decellularisert lungevev

Summary

Presentert her er en protokoll for isolering av regionalt decellularisert lungevev. Denne protokollen gir et kraftig verktøy for å studere kompleksiteter i ekstracellulær matrise og cellematriseinteraksjoner.

Abstract

Lungetransplantasjon er ofte eneste mulighet for pasienter i senere stadier av alvorlig lungesykdom, men dette begrenses både på grunn av tilgang på egnede donorlunger og både akutt og kronisk avstøtning etter transplantasjon. Å fastslå nye bioteknologiske tilnærminger for erstatning av syke lunger er avgjørende for å forbedre pasientens overlevelse og unngå komplikasjoner forbundet med dagens transplantasjonsmetoder. En alternativ tilnærming innebærer bruk av decellulariserte hele lunger som mangler cellulære bestanddeler som vanligvis er årsaken til akutt og kronisk avvisning. Siden lungen er et så komplekst organ, er det av interesse å undersøke de ekstracellulære matrikskomponentene i bestemte regioner, inkludert vaskulatur, luftveier og alveolært vev. Formålet med denne tilnærmingen er å etablere enkle og reproduserbare metoder som forskere kan dissekere og isolere regionspesifikt vev fra fullt decellulariserte lunger. Den nåværende protokollen er utarbeidet for gris og menneskelige lunger, men kan også brukes på andre arter. For denne protokollen ble fire regioner av vevet spesifisert: luftveier, vaskulatur, alveoler og bulk lungevev. Denne prosedyren tillater anskaffelse av prøver av vev som mer nøyaktig representerer innholdet i det decellulariserte lungevevvet i motsetning til tradisjonelle bulkanalysemetoder.

Introduction

Lungesykdommer, inkludert kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), idiopatisk lungefibrose (IPF) og cystisk fibrose (CF), forblir for tiden uten kur 1,2,3,4. Lungetransplantasjon er ofte eneste mulighet for pasienter i senere stadier, men dette er fortsatt et begrenset alternativ både på grunn av tilgang på egnede donorlunger og både akutt og kronisk avstøtning etter transplantasjon ^3,5,6. Som sådan er det et kritisk behov for nye behandlingsstrategier. En lovende tilnærming i respiratorisk bioteknologi er anvendelsen av vevsavledede stillaser fremstilt fra decellularisert innfødt lungevev. Som acellulære hele lungestillas beholder mye av kompleksiteten til den opprinnelige ekstracellulære matrisen (ECM) sammensetning og bioaktivitet, har de blitt intensivt studert for helorganteknikk og som forbedrede modeller for å studere lungesykdomsmekanismer 7,8,9,10. Parallelt er det økende interesse for å utnytte decellulariserte vev fra forskjellige organer, inkludert lunger, som hydrogeler og andre substrater for å studere cellecelle- og celle-ECM-interaksjoner i organoide og andre vevskulturmodeller 11,12,13,14,15,16,17 . Disse gir mer relevante modeller enn kommersielt tilgjengelige substrater, som Matrigel, avledet fra tumorkilder. Imidlertid er informasjon om humane lungeavledede hydrogeler relativt begrenset for tiden. Vi har tidligere beskrevet hydrogeler avledet fra decellulariserte grislunger og har karakterisert både deres mekaniske og materielle egenskaper, samt demonstrert deres nytte som cellekulturmodeller^18,19. En nylig rapport detaljerte den første mekaniske og viskoelastiske karakteriseringen av hydrogeler avledet fra decellulariserte normale og syke (KOL, IPF) menneskelige lunger²⁰. Vi har også presentert innledende data som karakteriserer glykosaminoglykaninnholdet i decellulariserte normale og KOLS humane lunger, samt deres anvendelighet for å studere cellecelle- og celle-ECM-interaksjoner¹¹.

Disse eksemplene illustrerer kraften i å utnytte decellulariserte humane lunge-ECM for undersøkelsesformål. Lungen er imidlertid et komplekst organ, og både struktur og funksjon varierer i forskjellige områder av lungen, inkludert ECM-sammensetning og andre egenskaper som stivhet^21,22. Som sådan er det av interesse å studere ECM i individuelle regioner i lungen, inkludert luftrøret og store luftveier, mellomstore og små luftveier og alveoler, samt store, mellomstore og små blodkar. For dette formål har vi utviklet en pålitelig og reproduserbar metode for å dissekere decellulariserte menneskelige og gris lunger og deretter isolere hver av disse anatomiske områdene. Dette har muliggjort detaljerte differensialanalyser av regionalt proteininnhold i både normale og syke lunger²¹.

Protocol

Alle dyreforsøk er utført i samsvar med IACUC ved University of Vermont (UVM). Alle menneskelige lunger ble anskaffet fra UVM Autopsy Services og relaterte studier ble utført i henhold til retningslinjene for IRB av UVM. MERK: Decellularisering av gris og menneskelige lunger har tidligere blitt beskrevet av vår gruppe 7,8,9,10,21.</su…

Representative Results

Et overordnet skjema over protokollen er vist i figur 1. Når mestret, er den regionale disseksjonen av decellularisert lungevev lett reproduserbar. Bestemmelse av kategoriseringen av hver avskåret vevsprøve er avgjørende for suksessen til disseksjonsprosedyren. Vaskulært vev er vesentlig mer elastisk enn luftveier, så bruk av tang for å strekke vevet er ofte en sterk indikator på om en bestemt prøve er vaskulatur eller luftveier. Vanligvis går vaskulært vev parallelt med luftveien…

Discussion

Decellularisert vev fra mennesker og andre arter brukes ofte som biomaterialer for å studere ECM-sammensetning samt celle-ECM-interaksjoner i ex vivo kulturmodeller, inkludert 3D-hydrogeler^12,13. I likhet med andre organer har decellulariserte lunger tidligere blitt brukt til å bestemme ECM-sammensetningsforskjeller i friske versus syke (dvs. emfysematøse og IPF) lunger og blir i økende grad brukt som hydrogeler for å studere ECM-dynamikk ^</sup…

Materials

Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10