Ontwikkeling van een voedingstestsysteem voor het evalueren van het insecticide effect van fytochemicaliën op Helicoverpa armigera

Summary

Dit protocol beschrijft de verplichte voedingstest om het potentieel toxische effect van een fytochemische stof op de larven van het lepidoptera-insect te evalueren. Dit is een zeer schaalbare insectenbioassay, waarmee de subletale en dodelijke dosis, afschrikkende activiteit en fysiologisch effect eenvoudig kunnen worden geoptimaliseerd. Dit zou kunnen worden gebruikt voor het screenen van milieuvriendelijke insecticiden.

Abstract

Helicoverpa armigera, een lepidoptera-insect, is een polyfaag plaag met een wereldwijde verspreiding. Dit plantenetende insect vormt een bedreiging voor planten en de landbouwproductiviteit. Als reactie hierop produceren planten verschillende fytochemicaliën die een negatieve invloed hebben op de groei en overleving van het insect. Dit protocol demonstreert een verplichte voedingstestmethode om het effect van een fytochemische stof (quercetine) op de groei, ontwikkeling en overleving van insecten te evalueren. Onder gecontroleerde omstandigheden werden de pasgeborenen tot de tweede instar op een vooraf gedefinieerd kunstmatig dieet gehouden. Deze larven van de tweede instar mochten zich gedurende 10 dagen voeden met een controle- en quercetinebevattend kunstmatig dieet. Het lichaamsgewicht, het ontwikkelingsstadium, het frassgewicht en de sterfte van de insecten werden om de andere dag geregistreerd. De verandering in lichaamsgewicht, het verschil in voedingspatroon en ontwikkelingsfenotypes werden gedurende de testtijd geëvalueerd. De beschreven verplichte voedingstest simuleert een natuurlijke wijze van inname en kan worden opgeschaald naar een groot aantal insecten. Het stelt iemand in staat om het effect van fytochemicaliën op de groeidynamiek, ontwikkelingsovergang en algehele fitheid van H. armigera te analyseren. Bovendien kan deze opstelling ook worden gebruikt om veranderingen in voedingsparameters en spijsverteringsfysiologische processen te evalueren. Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor voedingstestsystemen, die toepassingen kunnen hebben in toxicologische studies, screening van insecticide moleculen en het begrijpen van chemische effecten in plant-insectinteracties.

Introduction

De biotische factoren die de productiviteit van gewassen beïnvloeden, zijn voornamelijk ziekteverwekkers en plagen. Verschillende insectenplagen veroorzaken 15% tot 35% van het verlies van landbouwgewassen en beïnvloeden economische duurzaamheidspraktijken¹. Insecten die behoren tot de orden Coleoptera, Hemiptera en Lepidoptera zijn de belangrijkste orden van verwoestend ongedierte. De zeer adaptieve aard van de omgeving heeft lepidoptera’s geholpen bij het ontwikkelen van verschillende overlevingsmechanismen. Van de lepidoptera-insecten kan Helicoverpa armigera (katoenbolworm) zich voeden met ongeveer 180 verschillende gewassen en aanzienlijke schade toebrengen aan hun voortplantingsweefsels^. Wereldwijd heeft de H. armigera-plaag geresulteerd in een verlies van ongeveer $ 5 miljard³. Katoen, kikkererwten, duivenerwten, tomaten, zonnebloemen en andere gewassen zijn gastheren voor H. armigera. Het voltooit zijn levenscyclus op verschillende delen van waardplanten. Eieren die door vrouwelijke motten worden gelegd, worden op de bladeren uitgebroed, gevolgd door hun voeding met vegetatieve weefsels tijdens larvale stadia. Het larvale stadium is het meest destructief vanwege zijn vraatzuchtige en zeer aanpasbare aard ^4,5. H. armigera vertoont een wereldwijde verspreiding en aantasting van nieuwe gebieden vanwege zijn opmerkelijke eigenschappen, zoals polyfagie, uitstekende migratiecapaciteiten, hogere vruchtbaarheid, sterke diapauze en de opkomst van resistentie tegen bestaande insectenbestrijdingsstrategieën⁶.

Diverse chemische moleculen van terpenen, flavonoïden, alkaloïden, polyfenolen, cyanogene glucosiden en vele andere worden veel gebruikt voor de bestrijding van H. armigera-besmetting ⁷. Frequente toepassing van chemische moleculen heeft echter nadelige effecten op het milieu en de menselijke gezondheid als gevolg van de verwerving van hun residuen. Ook vertonen ze een nadelig effect op verschillende plaagroofdieren, wat resulteert in een ecologische onbalans ^8,9. Daarom is het noodzakelijk om veilige en milieuvriendelijke opties voor chemische moleculen voor ongediertebestrijding te onderzoeken.

Natuurlijke insectendodende moleculen die door planten worden geproduceerd (fytochemicaliën) kunnen worden gebruikt als een veelbelovend alternatief voor chemische bestrijdingsmiddelen. Deze fytochemicaliën omvatten verschillende secundaire metabolieten die behoren tot de klassen alkaloïden, terpenoïden en fenolen ^7,10. Quercetine is een van de meest voorkomende flavonoïden (fenolische verbinding) die aanwezig is in verschillende granen, groenten, fruit en bladeren. Het toont een afschrikkende en insectendodende werking tegen insecten; Ook is het niet schadelijk voor natuurlijke vijanden van ongedierte^11,12. Dit protocol demonstreert dus de voedingstest met behulp van quercetine om het toxische effect op H. armigera te beoordelen.

Er zijn verschillende bioassay-methoden ontwikkeld om het effect van natuurlijke en synthetische moleculen op de voedings-, groei-, ontwikkelings- en gedragspatronen van een insect te^evalueren13. Veelgebruikte methoden zijn onder meer de bladschijftest, keuzevoedingstest, druppelvoedingstest, contacttest, dieetdekkingstest en verplichte voedingstest^13,14. Deze methoden worden geclassificeerd op basis van hoe pesticiden op insecten worden toegepast. De verplichte voedingstest is een van de meest gebruikte, gevoelige, eenvoudige en aanpasbare methoden om waarschijnlijke insecticiden en hun dodelijke dosis te^testen14. Bij een verplichte voedingstest wordt het betreffende molecuul gemengd met een kunstmatig dieet. Dit zorgt voor consistentie en controle over de samenstelling van het dieet, waardoor robuuste en reproduceerbare resultaten worden gegenereerd. Belangrijke variabelen die van invloed zijn op voedingstesten zijn het ontwikkelingsstadium van het insect, de keuze van het insecticide, omgevingsfactoren en de steekproefomvang. De duur van de test, het interval tussen twee gegevensregistraties, de frequentie en hoeveelheid gevoerde voeding, de gezondheid van insecten en de hanteringsvaardigheid van operators kunnen ook van invloed zijn op de uitkomst van voedingstests^14,15.

Deze studie heeft tot doel de verplichte voedingstest aan te tonen om het effect van quercetine op de overleving en fitheid van H. armigera te evalueren. Beoordeling van verschillende parameters, zoals het lichaamsgewicht van insecten, sterftecijfer en ontwikkelingsstoornissen, zal inzicht geven in de insecticide effecten van quercetine. Ondertussen zal het meten van voedingsparameters, waaronder de efficiëntie van de conversie van ingenomen voedsel (ECI), de efficiëntie van de conversie van verteerd voedsel (ECD) en de geschatte verteerbaarheid (AD), de antivoedende eigenschappen van quercetine benadrukken.

Protocol

De larven van H. armigera werden verkregen van ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), Bangalore, India. Voor dit onderzoek werden in totaal 21 second instar-larven gebruikt. 1. Bereiding van een kunstmatig dieet op basis van kikkererwten OPMERKING: Een lijst met ingrediënten die nodig zijn voor het bereiden van een kunstmatig dieet wordt vermeld in tabel 1. Weeg alle fracties afzonderlijk …

Representative Results

Insectenlarven die werden gevoed met een dieet dat 1.000 ppm quercetine bevatte, vertoonden een significante afname van het lichaamsgewicht van ~57% in vergelijking met de controlegroep (Figuur 2A). De vermindering van het lichaamsgewicht resulteerde in een kleinere lichaamsgrootte van met quercetine behandelde larven (Figuur 2B). Er werd een opmerkelijke vermindering waargenomen in de voedingssnelheid van met quercetine gevoede larven in vergelijking met de con…

Discussion

Laboratoriumbioassays zijn nuttig om de uitkomsten te voorspellen en vergelijkende toxiciteitsgegevens te produceren voor verschillende verbindingen in een korte periode tegen een redelijke prijs. De voedingsbioassay helpt bij het interpreteren van de interacties tussen insect-insecticide en insect-plant-insecticiden. Het is een efficiënte methode voor het meten van de toxiciteit van een verscheidenheid aan stoffen die het proces van het vaststellen van de dodelijke dosis 50 (LD₅₀), de letale concentratie 50 …

Materials

Agar Agar	Himedia	RM666	Solidifying agent
Ascorbic acid	Himedia	CMS1014	Vitamin C source
Bengal Gram	NA	NA	Protein and carbohydrate source
Casein	Sigma	C-5890	Protein source
Cholesterol	Sisco Research Laboratories	34811	Fatty acid source
Choline Chloride	Himedia	GRM6824	Ammonium salt
DMSO	Sigma	67-68-5	Solvent
GraphPad Prism v8.0			https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
Methyl Paraben	Himedia	GRM1291	Antifungal agent
Multivitamin capsule	GalaxoSmithKline	NA	Vitamin source
Quercetin	Sigma	Q4951-10G	Phytochemical
Sorbic Acid	Himedia	M1880	Antimicrobail agent
Streptomycin	Himedia	CMS220	Antibiotic
Vitamin E capsule	Nukind Healthcare	NA	Vitamin E source
Yeast Extract	Himedia	RM027	Amino acid source