Entwicklung eines Fütterungs-Assay-Systems zur Bewertung der insektiziden Wirkung von sekundären Pflanzenstoffen auf Helicoverpa armigera

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den obligatorischen Fütterungstest, um die potenziell toxische Wirkung eines sekundären Pflanzenstoffs auf die Larven der Lepidoptera-Insekten zu bewerten. Dabei handelt es sich um einen hochgradig skalierbaren Insekten-Bioassay, mit dem sich die subletale und letale Dosis, die abschreckende Wirkung und die physiologische Wirkung leicht optimieren lassen. Dies könnte für das Screening umweltfreundlicher Insektizide verwendet werden.

Abstract

Helicoverpa armigera, ein Lepidoptera-Insekt, ist ein polyphager Schädling mit weltweiter Verbreitung. Dieses pflanzenfressende Insekt ist eine Bedrohung für Pflanzen und die landwirtschaftliche Produktivität. Als Reaktion darauf produzieren Pflanzen mehrere sekundäre Pflanzenstoffe, die sich negativ auf das Wachstum und Überleben des Insekts auswirken. Dieses Protokoll demonstriert eine obligatorische Fütterungstestmethode, um die Wirkung eines sekundären Pflanzenstoffs (Quercetin) auf das Wachstum, die Entwicklung und das Überleben von Insekten zu bewerten. Unter kontrollierten Bedingungen wurden die Neugeborenen bis zum zweiten Instar mit einer vordefinierten künstlichen Diät gehalten. Diese Larven durften sich 10 Tage lang von einer Kontroll- und Quercetin-haltigen Kunstnahrung ernähren. Das Körpergewicht, das Entwicklungsstadium, das Fraßgewicht und die Sterblichkeit der Insekten wurden an abwechselnden Tagen aufgezeichnet. Die Veränderung des Körpergewichts, der Unterschied im Fütterungsmuster und die Entwicklungsphänotypen wurden während der gesamten Testzeit bewertet. Der beschriebene obligatorische Fütterungsassay simuliert eine natürliche Art der Aufnahme und kann auf eine große Anzahl von Insekten hochskaliert werden. Es ermöglicht die Analyse der Wirkung von sekundären Pflanzenstoffen auf die Wachstumsdynamik, den Entwicklungsübergang und die allgemeine Fitness von H. armigera. Darüber hinaus kann dieser Aufbau auch verwendet werden, um Veränderungen von Ernährungsparametern und verdauungsphysiologischen Prozessen zu bewerten. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Methodik für Fütterungs-Assay-Systeme, die in toxikologischen Studien, beim Screening von insektiziden Molekülen und zum Verständnis chemischer Effekte bei Pflanzen-Insekten-Interaktionen eingesetzt werden können.

Introduction

Die biotischen Faktoren, die die Produktivität der Pflanzen beeinflussen, sind hauptsächlich Krankheitserreger und Schädlinge. Mehrere Schadinsekten verursachen 15 % bis 35 % der landwirtschaftlichen Ernteverluste und beeinträchtigen die wirtschaftliche Nachhaltigkeit¹. Insekten, die zu den Ordnungen Coleoptera, Hemiptera und Lepidoptera gehören, sind die Hauptordnungen der verheerenden Schädlinge. Die hochgradig anpassungsfähige Natur der Umwelt hat den Schmetterlingen bei der Entwicklung mehrerer Überlebensmechanismen geholfen. Unter den Schmetterlingsinsekten kann sich Helicoverpa armigera (Baumwollkapselwurm) von etwa 180 verschiedenen Nutzpflanzen ernähren und deren Fortpflanzungsgewebe erheblich schädigen². Weltweit hat der Befall mit H. armigera zu einem Verlust von rund 5 Milliarden US-Dollar geführt³. Baumwolle, Kichererbsen, Taubenerbsen, Tomaten, Sonnenblumen und andere Nutzpflanzen sind Wirte für H. armigera. Es vervollständigt seinen Lebenszyklus an verschiedenen Teilen der Wirtspflanze. Die Eier der Mottenweibchen schlüpfen auf den Blättern, gefolgt von ihrer Ernährung im vegetativen Gewebe während der Larvenstadien. Das Larvenstadium ist aufgrund seiner gefräßigen und sehr anpassungsfähigen Natur am zerstörerischsten ^4,5. H. armigera zeigt eine globale Verbreitung und ein Vordringen in neue Territorien aufgrund seiner bemerkenswerten Eigenschaften wie Polyphagie, ausgezeichnete Wanderfähigkeiten, höhere Fruchtbarkeit, starke Diapause und das Aufkommen von Resistenzen gegen bestehende Insektenbekämpfungsstrategien⁶.

Verschiedene chemische Moleküle aus Terpenen, Flavonoiden, Alkaloiden, Polyphenolen, cyanogenen Glucosiden und vielen anderen werden häufig zur Bekämpfung des H. armigera-Befalls verwendet⁷. Die häufige Anwendung chemischer Moleküle hat jedoch aufgrund der Aufnahme ihrer Rückstände nachteilige Auswirkungen auf die Umwelt und die menschliche Gesundheit. Außerdem wirken sie sich nachteilig auf verschiedene Schädlingsfresser aus, was zu einem ökologischen Ungleichgewicht führt ^8,9. Daher besteht die Notwendigkeit, sichere und umweltfreundliche Optionen für chemische Moleküle zur Schädlingsbekämpfung zu untersuchen.

Natürliche insektizide Moleküle, die von Pflanzen produziert werden (sekundäre Pflanzenstoffe), können als vielversprechende Alternative zu chemischen Pflanzenschutzmitteln eingesetzt werden. Zu diesen sekundären Pflanzenstoffen gehören verschiedene Sekundärmetaboliten, die zu den Klassen Alkaloide, Terpenoide und Phenole gehören ^7,10. Quercetin ist eines der am häufigsten vorkommenden Flavonoide (phenolische Verbindung), die in verschiedenen Getreidesorten, Gemüse, Obst und Blättern enthalten sind. Es zeigt eine abschreckende und insektizide Wirkung gegen Insekten; Es ist auch nicht schädlich für natürliche Feinde von Schädlingen^11,12. Somit demonstriert dieses Protokoll den Fütterungsassay mit Quercetin, um seine toxische Wirkung auf H. armigera zu bewerten.

Es wurden verschiedene Bioassay-Methoden entwickelt, um die Wirkung natürlicher und synthetischer Moleküle auf die Nahrungs-, Wachstums-, Entwicklungs- und Verhaltensmuster eines Insekts zu bewerten¹³. Zu den häufig verwendeten Methoden gehören der Blattscheiben-Assay, der Choice-Fütterungs-Assay, der Tröpfchen-Fütterungs-Assay, der Kontakt-Assay, der Diät-Covering-Assay und der obligate Fütterungs-Assay^13,14. Diese Methoden werden danach klassifiziert, wie Pestizide auf Insekten angewendet werden. Der obligate Fütterungstest ist eine der am häufigsten verwendeten, empfindlichsten, einfachen und anpassungsfähigsten Methoden, um wahrscheinliche Insektizide und ihre tödliche Dosis zu testen¹⁴. In einem obligaten Fütterungsassay wird das interessierende Molekül mit einer künstlichen Nahrung vermischt. Dies sorgt für Konsistenz und Kontrolle über die Zusammensetzung des Futters und führt zu robusten und reproduzierbaren Ergebnissen. Wichtige Variablen, die die Fütterungstests beeinflussen, sind das Entwicklungsstadium des Insekts, die Wahl des Insektizids, Umweltfaktoren und die Probengröße. Die Dauer des Assays, das Intervall zwischen zwei Datenaufzeichnungen, die Häufigkeit und Menge der gefütterten Nahrung, die Gesundheit der Insekten und die Handhabungsfähigkeit der Bediener können das Ergebnis der Fütterungsassays ebenfalls beeinflussen^14,15.

Ziel dieser Studie ist es, den obligatorischen Fütterungsassay zu demonstrieren, um die Wirkung von Quercetin auf das Überleben und die Fitness von H. armigera zu bewerten. Die Bewertung verschiedener Parameter, wie z.B. das Körpergewicht der Insekten, die Sterblichkeitsrate und Entwicklungsstörungen, wird Einblicke in die insektizide Wirkung von Quercetin geben. In der Zwischenzeit wird die Messung von Ernährungsparametern, einschließlich der Effizienz der Umwandlung von aufgenommener Nahrung (ECI), der Effizienz der Umwandlung von verdauter Nahrung (ECD) und der ungefähren Verdaulichkeit (AD), die antifeedativen Eigenschaften von Quercetin hervorheben.

Protocol

Die Larven von H. armigera wurden vom ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR) in Bangalore, Indien, erworben. Für die vorliegende Studie wurden insgesamt 21 Second-Instar-Larven verwendet. 1. Zubereitung einer künstlichen Diät auf Kichererbsenbasis HINWEIS: Eine Liste der Zutaten, die für die Zubereitung einer künstlichen Diät erforderlich sind, ist in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Frakti…

Representative Results

Insektenlarven, die mit einer Diät gefüttert wurden, die 1.000 ppm Quercetin enthielt, zeigten eine signifikante Abnahme des Körpergewichts von ~57% im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 2A). Die Verringerung des Körpergewichts führte zu einer reduzierten Körpergröße der mit Quercetin behandelten Larven (Abbildung 2B). Es wurde eine deutliche Verringerung der Fressrate der mit Quercetin gefütterten Larven im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet …

Discussion

Labor-Bioassays sind nützlich, um Ergebnisse vorherzusagen und vergleichende Toxizitätsdaten für mehrere Verbindungen in kurzer Zeit zu vertretbaren Kosten zu erstellen. Der Fütterungsbioassay hilft bei der Interpretation der Wechselwirkungen zwischen Insekten-Insektizid und Insekten-Pflanze-Insektiziden. Es handelt sich um eine effiziente Methode zur Messung der Toxizität einer Vielzahl von Substanzen, die den Prozess der Bestimmung der letalen Dosis 50 (LD₅₀), der letalen Konzentration 50 (LC_50</su…

Materials

Agar Agar	Himedia	RM666	Solidifying agent
Ascorbic acid	Himedia	CMS1014	Vitamin C source
Bengal Gram	NA	NA	Protein and carbohydrate source
Casein	Sigma	C-5890	Protein source
Cholesterol	Sisco Research Laboratories	34811	Fatty acid source
Choline Chloride	Himedia	GRM6824	Ammonium salt
DMSO	Sigma	67-68-5	Solvent
GraphPad Prism v8.0			https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
Methyl Paraben	Himedia	GRM1291	Antifungal agent
Multivitamin capsule	GalaxoSmithKline	NA	Vitamin source
Quercetin	Sigma	Q4951-10G	Phytochemical
Sorbic Acid	Himedia	M1880	Antimicrobail agent
Streptomycin	Himedia	CMS220	Antibiotic
Vitamin E capsule	Nukind Healthcare	NA	Vitamin E source
Yeast Extract	Himedia	RM027	Amino acid source