Sviluppo di un sistema di dosaggio per l'alimentazione per la valutazione dell'effetto insetticida di sostanze fitochimiche su Helicoverpa armigera
Summary
Questo protocollo descrive il saggio di alimentazione obbligata per valutare l’effetto potenzialmente tossico di un fitochimico sulle larve di insetti lepidotteri. Si tratta di un test biologico per insetti altamente scalabile, facile da ottimizzare la dose subletale e letale, l’attività deterrente e l’effetto fisiologico. Questo potrebbe essere utilizzato per lo screening di insetticidi ecologici.
Abstract
L’Helicoverpa armigera, un insetto lepidottero, è un parassita polifago con una distribuzione mondiale. Questo insetto erbivoro è una minaccia per le piante e la produttività agricola. In risposta, le piante producono diverse sostanze fitochimiche che hanno un impatto negativo sulla crescita e sulla sopravvivenza dell’insetto. Questo protocollo dimostra un metodo di dosaggio obbligatorio per valutare l’effetto di un fitochimico (quercetina) sulla crescita, lo sviluppo e la sopravvivenza degli insetti. In condizioni controllate, i neonati sono stati mantenuti fino al secondo stadio con una dieta artificiale predefinita. A queste larve di secondo stadio è stato permesso di nutrirsi con una dieta artificiale di controllo e contenente quercetina per 10 giorni. Il peso corporeo degli insetti, lo stadio di sviluppo, il peso del frass e la mortalità sono stati registrati a giorni alterni. La variazione del peso corporeo, la differenza nel modello di alimentazione e i fenotipi di sviluppo sono stati valutati per tutto il tempo del test. Il test di alimentazione obbligatoria descritto simula una modalità naturale di ingestione e può essere scalato fino a un gran numero di insetti. Permette di analizzare l’effetto delle sostanze fitochimiche sulle dinamiche di crescita, sulla transizione evolutiva e sulla fitness generale di H. armigera. Inoltre, questa configurazione può essere utilizzata anche per valutare le alterazioni dei parametri nutrizionali e dei processi fisiologici digestivi. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per l’alimentazione dei sistemi di analisi, che può avere applicazioni negli studi tossicologici, nello screening delle molecole insetticide e nella comprensione degli effetti chimici nelle interazioni pianta-insetto.
Introduction
I fattori biotici che influenzano la produttività delle colture sono principalmente agenti patogeni e parassiti. Diversi insetti nocivi causano dal 15% al 35% delle perdite di raccolto agricolo e incidono sulle pratiche di sostenibilità economica1. Gli insetti appartenenti agli ordini Coleotteri, Emitteri e Lepidotteri sono i principali ordini di parassiti devastanti. La natura altamente adattativa dell’ambiente ha favorito i lepidotteri nell’evoluzione di diversi meccanismi di sopravvivenza. Tra gli insetti lepidotteri, l’Helicoverpa armigera può nutrirsi di circa 180 colture diverse e causare danni significativi ai loro tessuti riproduttivi2. In tutto il mondo, l’infestazione da H. armigera ha provocato una perdita di circa 5 miliardi di dollari. Cotone, ceci, piselli piccione, pomodori, girasoli e altre colture ospitano H. armigera. Completa il suo ciclo di vita su diverse parti delle piante ospiti. Le uova deposte dalle falene femmine si schiudono sulle foglie, seguite dalla loro alimentazione dei tessuti vegetativi durante gli stadi larvali. Lo stadio larvale è il più distruttivo a causa della sua natura vorace e altamente adattabile 4,5. H. armigera mostra una distribuzione globale e l’invasione di nuovi territori grazie alle sue notevoli caratteristiche, come la polifagia, le eccellenti capacità migratorie, la maggiore fecondità, la forte diapausa e l’emergere di resistenza alle strategie di controllo degli insetti esistenti6.
Diverse molecole chimiche da terpeni, flavonoidi, alcaloidi, polifenoli, glucosidi cianogenici e molti altri sono ampiamente utilizzate per il controllo dell’infestazione da H. armigera 7. Tuttavia, l’applicazione frequente di molecole chimiche ha effetti negativi sull’ambiente e sulla salute umana a causa dell’acquisizione dei loro residui. Inoltre, mostrano un effetto dannoso su vari predatori di parassiti, con conseguente squilibrio ecologico 8,9. Pertanto, è necessario studiare opzioni sicure ed ecologiche per le molecole chimiche di controllo dei parassiti.
Le molecole insetticide naturali prodotte dalle piante (sostanze fitochimiche) possono essere utilizzate come una promettente alternativa ai pesticidi chimici. Queste sostanze fitochimiche includono vari metaboliti secondari appartenenti alle classi alcaloidi, terpenoidi e fenolici 7,10. La quercetina è uno dei flavonoidi (composti fenolici) più abbondanti presenti in vari cereali, verdure, frutta e foglie. Mostra attività alimentare deterrente e insetticida contro gli insetti; Inoltre, non è dannoso per i nemici naturali dei parassiti11,12. Pertanto, questo protocollo dimostra il test di alimentazione utilizzando la quercetina per valutare il suo effetto tossico su H. armigera.
Sono stati sviluppati vari metodi di analisi biologica per valutare l’effetto di molecole naturali e sintetiche sull’alimentazione, la crescita, lo sviluppo e i modelli comportamentali di un insetto13. I metodi comunemente usati includono il saggio del disco fogliare, il saggio di alimentazione a scelta, il saggio di alimentazione a gocce, il saggio di contatto, il saggio di copertura della dieta e il saggio di alimentazione obbligata13,14. Questi metodi sono classificati in base a come i pesticidi vengono applicati agli insetti. Il test di alimentazione obbligata è uno dei metodi più comunemente usati, sensibili, semplici e adattabili per testare i probabili insetticidi e la loro dose letale14. In un saggio di alimentazione obbligata, la molecola di interesse viene miscelata con una dieta artificiale. Ciò fornisce coerenza e controllo sulla composizione della dieta, generando risultati robusti e riproducibili. Variabili importanti che influenzano i saggi di alimentazione sono lo stadio di sviluppo dell’insetto, la scelta dell’insetticida, i fattori ambientali e la dimensione del campione. Anche la durata del test, l’intervallo tra due registrazioni di dati, la frequenza e la quantità di alimentazione dietetica, la salute degli insetti e l’abilità di manipolazione degli operatori possono influenzare l’esito dei test di alimentazione14,15.
Questo studio mira a dimostrare il test di alimentazione obbligata per valutare l’effetto della quercetina sulla sopravvivenza e sulla fitness di H. armigera . La valutazione di vari parametri, come il peso corporeo dell’insetto, il tasso di mortalità e i difetti dello sviluppo, fornirà approfondimenti sugli effetti insetticidi della quercetina. Nel frattempo, la misurazione dei parametri nutrizionali, tra cui l’efficienza della conversione degli alimenti ingeriti (ECI), l’efficienza della conversione degli alimenti digeriti (ECD) e la digeribilità approssimativa (AD), evidenzierà gli attributi antifeedant della quercetina.
Protocol
Representative Results
Discussion
I saggi biologici di laboratorio sono utili per prevedere i risultati e produrre dati comparativi sulla tossicità di diversi composti in un breve periodo a un costo ragionevole. Il biosaggio di alimentazione aiuta a interpretare le interazioni tra insetticida e insetticida e insetticidi per piante e insetticidi. Si tratta di un metodo efficace per misurare la tossicità di una varietà di sostanze che semplifica notevolmente il processo di determinazione della dose letale 50 (LD50), della concentrazione letal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SM, YP e VN riconoscono la borsa di studio assegnata dalla Commissione per le sovvenzioni universitarie, Governo dell’India, Nuova Delhi. RJ ringrazia il Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), India, e il CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, India, per il sostegno finanziario ai sensi dei codici di progetto MLP036626, MLP101526 e YSA000826.
Materials
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
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