Разработка системы кормового анализа для оценки инсектицидного действия фитохимикатов на Helicoverpa armigera
Summary
В этом протоколе описывается облигатный анализ кормления для оценки потенциально токсического действия фитохимического вещества на личинок чешуекрылых насекомых. Это высокомасштабируемый биотест на насекомых, легко оптимизирующий сублетальную и смертельную дозу, отпугивающую активность и физиологический эффект. Это может быть использовано для скрининга экологически чистых инсектицидов.
Abstract
Helicoverpa armigera, чешуекрылое насекомое, является многоядным вредителем с мировым распространением. Это травоядное насекомое представляет угрозу для растений и продуктивности сельского хозяйства. В ответ растения вырабатывают несколько фитохимических веществ, которые негативно влияют на рост и выживание насекомого. Этот протокол демонстрирует метод облигатного анализа кормления для оценки влияния фитохимического вещества (кверцетина) на рост, развитие и выживание насекомых. В контролируемых условиях новорожденных содержали до второго возраста на заранее определенном искусственном рационе. Этим личинкам второго возраста было позволено питаться контрольной и содержащей кверцетин искусственной пищей в течение 10 дней. Масса тела насекомых, стадия развития, масса тела и смертность регистрировались через день. Изменение массы тела, различия в характере питания и фенотипы развития оценивались на протяжении всего времени анализа. Описанный анализ обязательного кормления имитирует естественный способ проглатывания и может быть масштабирован до большого количества насекомых. Это позволяет проанализировать влияние фитохимических веществ на динамику роста, переход в развитие и общую приспособленность H. armigera. Кроме того, эта установка также может быть использована для оценки изменений в параметрах питания и физиологических процессах пищеварения. В этой статье представлена подробная методология систем анализа кормов, которая может быть применена в токсикологических исследованиях, скрининге инсектицидных молекул и понимании химических эффектов при взаимодействии растений и насекомых.
Introduction
Биотическими факторами, влияющими на урожайность сельскохозяйственных культур, являются в основном патогенные агенты и вредители. Некоторые насекомые-вредители являются причиной от 15% до 35% потерь сельскохозяйственных культур и влияют на практику экономической устойчивости1. Насекомые, принадлежащие к отрядам жесткокрылых, полужесткокрылых и чешуекрылых, являются основными отрядами разрушительных вредителей. Высокоадаптивная природа окружающей среды способствовала развитию у чешуекрылых нескольких механизмов выживания. Среди чешуекрылых насекомых Helicoverpa armigera (хлопковый коробочный червь) может питаться примерно 180 различными сельскохозяйственными культурами и наносить значительный ущерб их репродуктивным тканям2. Во всем мире заражение H. armigera привело к убыткам в размере около 5 миллиардов долларовСША3. Хлопчатник, нут, голубиный горох, помидоры, подсолнечник и другие культуры являются хозяевами H. armigera. Он завершает свой жизненный цикл на разных частях растений-хозяев. Яйца, отложенные самками бабочек, вылупляются на листьях, после чего питаются вегетативными тканями на личиночных стадиях. Личиночная стадия является наиболее разрушительной из-за своей прожорливой и хорошо приспосабливающейся природы 4,5. H. armigera демонстрирует глобальное распространение и вторжение на новые территории благодаря своим замечательным признакам, таким как полифагия, отличные миграционные способности, более высокая плодовитость, сильная диапауза и появление устойчивости к существующим стратегиям борьбы с насекомыми6.
Различные химические молекулы, такие как терпены, флавоноиды, алкалоиды, полифенолы, цианогенные глюкозиды и многие другие, широко используются для борьбы с инвазией H. armigera 7. Однако частое применение химических молекул оказывает неблагоприятное воздействие на окружающую среду и здоровье человека из-за приобретения их остатков. Кроме того, они оказывают губительное воздействие на различных хищников-вредителей, что приводит к экологическому дисбалансу 8,9. Поэтому возникает необходимость в исследовании безопасных и экологичных вариантов химических молекул борьбы с вредителями.
Природные инсектицидные молекулы, продуцируемые растениями (фитохимикаты), могут быть использованы в качестве перспективной альтернативы химическим пестицидам. К таким фитохимическим веществам относятся различные вторичные метаболиты, принадлежащие к классам алкалоидов, терпеноидов и фенольных соединений 7,10. Кверцетин является одним из самых распространенных флавоноидов (фенольных соединений), присутствующих в различных зернах, овощах, фруктах и листьях. Проявляет кормовую отпугивающую и инсектицидную активность против насекомых; Также он не вреден для естественных врагов вредителей11,12. Таким образом, данный протокол демонстрирует анализ кормления с использованием кверцетина для оценки его токсического действия на H. armigera.
Для оценки влияния природных и синтетических молекул на питание, рост, развитие и поведение насекомых были разработаны различные методы биотестирования13. Обычно используемые методы включают анализ листового диска, анализ отборного кормления, анализ капельного питания, контактный анализ, анализ покрытия диеты и анализ облигатного кормления13,14. Эти методы классифицируются в зависимости от того, как пестициды применяются к насекомым. Анализ на облигатное кормление является одним из наиболее часто используемых, чувствительных, простых и адаптируемых методов для тестирования вероятных инсектицидов и их смертельной дозы14. В анализе на облигатное кормление интересующая молекула смешивается с искусственной пищей. Это обеспечивает постоянство и контроль над составом рациона, обеспечивая надежные и воспроизводимые результаты. Важными переменными, влияющими на анализ питания, являются стадия развития насекомого, выбор инсектицида, факторы окружающей среды и размер образца. Продолжительность анализа, интервал между двумя записями данных, частота и количество корма, состояние здоровья насекомых и навыки обращения операторов также могут влиять на исход анализов кормления14,15.
Это исследование направлено на демонстрацию анализа на облигатное кормление для оценки влияния кверцетина на выживаемость и приспособленность H. armigera . Оценка различных параметров, таких как масса тела насекомых, уровень смертности и дефекты развития, даст представление об инсектицидных эффектах кверцетина. Между тем, измерение параметров питания, включая эффективность конверсии проглоченной пищи (ECI), эффективность конверсии переваренной пищи (ECD) и приблизительную усвояемость (AD), выявит антифидентные свойства кверцетина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Лабораторные биотесты полезны для прогнозирования результатов и получения сравнительных данных о токсичности нескольких соединений за короткий период времени по разумной цене. Биопроба кормления помогает интерпретировать взаимодействие между инсектицидами и инсектицидами типа «н…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SM, YP и VN выражают признательность за стипендию, присужденную Комиссией по университетским грантам правительства Индии, Нью-Дели. RJ выражает признательность Совету по научным и промышленным исследованиям (CSIR), Индия, и CSIR-Национальной химической лаборатории, Пуна, Индия, за финансовую поддержку в соответствии с кодами проектов MLP036626, MLP101526 и YSA000826.
Materials
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
- Popp, J., Pető, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2013).
- da Silva, F. R., et al. Comparative toxicity of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) to selected insecticides. Insects. 11 (7), 431 (2020).
- Usman, A., Ali, M. I., Shah, M., e Amin, F., Sarwar, J. Comparative efficacy of indigenous plant extracts and a synthetic insecticide for the management of tomato fruit worm (Helicoverpa armigera Hub.) and their effect on natural enemies in tomato crop. Pure and Applied Biology. 7 (3), 1014-1020 (2018).
- Honnakerappa, S. B., Udikeri, S. S. Abundance of Helicoverpa armigera (Hubner) on different host crops. Journal of Farm Science. 31, 436-439 (2018).
- Edosa, T. T. Review on bio-intensive management of African bollworm, Helicoverpa armigera (Hub.): Botanicals and semiochemicals perspectives. African Journal of Agricultural Research. 14 (1), 1-9 (2019).
- Zhou, Y., et al. Migratory Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) exhibits marked seasonal variation in morphology and fitness. Environmental Entomology. 48 (3), 755-763 (2019).
- Souto, A. L., et al. Plant-derived pesticides as an alternative to pest management and sustainable agricultural production: Prospects, applications and challenges. Molecules. 26 (16), 4835 (2021).
- Özkara, A., Akyıl, D., Konuk, M. Pesticides, environmental pollution, and health. Environmental Health Risk-Hazardous Factors to Living Species. , (2016).
- Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -. Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42 (2021).
- Tlak Gajger, I., Dar, S. A. Plant allelochemicals as sources of insecticides. Insects. 12 (3), 189 (2021).
- Riddick, E. W. Potential of quercetin to reduce herbivory without disrupting natural enemies and pollinators. Agriculture. 11 (6), 476 (2021).
- Gao, Y. -. L., et al. The effect of quercetin on the growth, development, nutrition utilization, and detoxification enzymes in Hyphantria cunea Drury (Lepidoptera: Arctiidae). Forests. 13 (11), 1945 (2022).
- Durmuşoğlu, E., Hatipoğlu, A., Gürkan, M. O., Moores, G. Comparison of different bioassay methods for determining insecticide resistance in European Grapevine Moth, Lobesia botrana (Denis & Schiffermüller) (Lepidoptera: Tortricidae). Turkish Journal of Entomology. 39 (3), 271-276 (2015).
- Paramasivam, M., Selvi, C. Laboratory bioassay methods to assess the insecticide toxicity against insect pests-A review. Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (3), 1441-1445 (2017).
- Clark, E. L., Isitt, R., Plettner, E., Fields, P. G., Huber, D. P. W. An inexpensive feeding bioassay technique for stored-product insects. Journal of Economic Entomology. 107 (1), 455-461 (2014).
- Waldbauer, G. P., Cohen, R. W., Friedman, S. An improved procedure for laboratory rearing of the corn earworm, Heliothis zea (Lepidoptera: Noctuidae). The Great Lakes Entomologist. 17 (2), 10 (2017).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Laboratory rearing of stable flies and other muscoid Diptera. JoVE. (138), e57341 (2018).
- Zheng, M. -. L., Zhang, D. -. J., Damiens, D. D., Lees, R. S., Gilles, J. R. L. Standard operating procedures for standardized mass rearing of the dengue and chikungunya vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)-II-Egg storage and hatching. Parasites & Vectors. 8, 1-7 (2015).
- Nagarkatti, S., Prakash, S. Rearing Heliothis armigera (Hubn.) on an artificial diet. Technical Bulletin Commonwealth Institute of Biological Control. , (1974).
- Adhav, A. S., Kokane, S. R., Joshi, R. S. Functional characterization of Helicoverpa armigera trehalase and investigation of physiological effects caused due to its inhibition by Validamycin A formulation. International Journal of Biological Macromolecules. 112, 638-647 (2018).
- Abbasi, B. H., et al. Rearing the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, on a tapioca-based artificial diet. Journal of Insect Science. 7 (1), 35 (2007).
- Armes, N. J., Jadhav, D. R., Bond, G. S., King, A. B. S. Insecticide resistance in Helicoverpa armigera in South India. Pesticide Science. 34 (4), 355-364 (1992).
- Waldbauer, G. P. The consumption and utilization of food by insects. Advances in Insect Physiology. 5, 229-288 (1968).
- Carpinella, M. C., Defago, M. T., Valladares, G., Palacios, S. M. Antifeedant and insecticide properties of a limonoid from Melia azedarach (Meliaceae) with potential use for pest management. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (2), 369-374 (2003).
- Diaz Napal, G. N., Palacios, S. M. Bioinsecticidal effect of the flavonoids pinocembrin and quercetin against Spodoptera frugiperda. Journal of Pest Science. 88, 629-635 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , 4-38 (1990).
- Gikonyo, N. K., Mwangi, R. W., Midiwo, J. O. Toxicity and growth-inhibitory activity of Polygonum senegalense (Meissn.) surface exudate against Aedes aegypti larvae. International Journal of Tropical Insect Science. 18 (3), 229-234 (1998).
- Sharma, R., Sohal, S. K. Bioefficacy of quercetin against melon fruit fly. Bulletin of Insectology. 66 (1), 79-83 (2013).
- Després, L., David, J. -. P., Gallet, C. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 298-307 (2007).
- Shi, G., Kang, Z., Ren, F., Zhou, Y., Guo, P. Effects of quercetin on the growth and expression of immune-pathway-related genes in silkworm (Lepidoptera: Bombycidae). Journal of Insect Science. 20 (6), 23 (2020).
- Selin-Rani, S., et al. Toxicity and physiological effect of quercetin on generalist herbivore, Spodoptera litura Fab. and a non-target earthworm Eisenia fetida Savigny. Chemosphere. 165, 257-267 (2016).
- Ateyyat, M., Abu-Romman, S., Abu-Darwish, M., Ghabeish, I. Impact of flavonoids against woolly apple aphid, Eriosoma lanigerum (Hausmann) and its sole parasitoid, Aphelinus mali (Hald). Journal of Agricultural Science. 4 (2), 227 (2012).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. JoVE. (144), e57768 (2019).
- Mitchell, C., Brennan, R. M., Graham, J., Karley, A. J. Plant defense against herbivorous pests: exploiting resistance and tolerance traits for sustainable crop protection. Frontiers in Plant Science. 7, 1132 (2016).
