כימות סלקטיביות תכונות חזותיות של רפלקס האופטוקינטי בעכברים
Summary
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי לכימות הרפלקס האופטוקינטי. הוא משלב גירוי תוף וירטואלי ווידאו-אוקולוגרפיה, ובכך מאפשר הערכה מדויקת של סלקטיביות התכונה של ההתנהגות והפלסטיות האדפטיבית שלה.
Abstract
הרפלקס האופטוקינטי (OKR) הוא תנועת עיניים מולדת חיונית המופעלת על ידי התנועה הגלובלית של הסביבה החזותית ומשמשת לייצוב תמונות רשתית. בשל חשיבותו וחוסנו, ה-OKR שימש לחקר למידה חזותית-מוטורית ולהערכת תפקודי הראייה של עכברים בעלי רקע גנטי שונה, גילאים שונים וטיפולים תרופתיים. כאן, אנו מציגים הליך להערכת תגובות OKR של עכברים קבועים ראש עם דיוק גבוה. קיבוע ראש יכול לשלול את תרומת הגירוי הווסטיבולרי על תנועות העיניים, מה שמאפשר למדוד תנועות עיניים המופעלות רק על ידי תנועה חזותית. ה-OKR מופעל על ידי מערכת תופים וירטואלית, שבה סורג אנכי המוצג על שלושה צגי מחשב נסחף אופקית באופן תנודתי או חד-כיווני במהירות קבועה. באמצעות מערכת מציאות מדומה זו, אנו יכולים לשנות באופן שיטתי פרמטרים חזותיים כמו תדר מרחבי, תדר טמפורלי/תנודה, ניגודיות, בהיקות וכיוון הגרגים, ולכמת עקומות כוונון של סלקטיביות תכונות חזותיות. וידאו-אוקוקולוגרפיה אינפרא אדום במהירות גבוהה מבטיחה מדידה מדויקת של מסלול תנועות העיניים. עיניהם של עכברים בודדים מכוילים כדי לספק הזדמנויות להשוות את ה-OKR בין בעלי חיים בגילאים, מינים שונים ומרקעים גנטיים שונים. כוחה הכמותי של טכניקה זו מאפשר לה לזהות שינויים ב- OKR כאשר התנהגות זו מסתגלת באופן פלסטי עקב הזדקנות, חוויה חושית או למידה מוטורית; לפיכך, היא הופכת טכניקה זו לתוספת רבת ערך לרפרטואר הכלים המשמשים לחקר הפלסטיות של התנהגויות עיניות.
Introduction
בתגובה לגירויים חזותיים בסביבה, העיניים שלנו נעות כדי להסיט את מבטנו, לייצב תמונות רשתית, לעקוב אחר מטרות נעות, או ליישר את הגומות של שתי עיניים עם מטרות הממוקמות במרחקים שונים מהצופה, שהן חיוניות לראייה תקינה 1,2. התנהגויות אוקולומוטוריות שימשו באופן נרחב כמודלים אטרקטיביים של אינטגרציה סנסומוטורית להבנת המעגלים העצביים בבריאות ובחולי, לפחות חלקית בגלל הפשטות של המערכת האוקולומוטורית3. נשלטת על ידי שלושה זוגות של שרירים חוץ-עיניים, העין מסתובבת בשקע בעיקר סביב שלושה צירים תואמים: הגבהה ודיכאון לאורך הציר הרוחבי, חטיפה וחטיפה לאורך הציר האנכי, וחדירה ושחול לאורך הציר הקדמי 1,2. מערכת פשוטה כזו מאפשרת לחוקרים להעריך את ההתנהגויות האוקולומוטוריות של עכברים בקלות ובדייקנות בסביבת מעבדה.
התנהגות אוקולומוטורית עיקרית אחת היא רפלקס אופטוקינטי (OKR). תנועת עיניים לא רצונית זו מופעלת על ידי סחף איטי או החלקות של תמונות על הרשתית ומשמשת לייצוב תמונות הרשתית כאשר ראשו של בעל חיים או סביבתו נעים 2,4. ה-OKR, כפרדיגמה התנהגותית, מעניינת את החוקרים מכמה סיבות. ראשית, ניתן לגרות אותו באופן אמין ולכמת אותו במדויק 5,6. שנית, ההליכים לכימות התנהגות זו הם פשוטים יחסית וסטנדרטיים וניתן ליישם אותם כדי להעריך את הפונקציות החזותיות של קבוצה גדולה של בעלי חיים7. שלישית, התנהגות מולדת זו היא פלסטית מאוד 5,8,9. המשרעת שלו יכולה להיות מוגברת כאשר החלקות רשתית חוזרות ונשנות מתרחשות במשך זמן רב 5,8,9, או כאשר שותפו לעבודה רפלקס עיני שיווי משקל (VOR), מנגנון נוסף של ייצוב תמונות רשתית המופעלות על ידי קלט שיווי משקל2, נפגע5. פרדיגמות ניסיוניות אלה של הגברה OKR מאפשרות לחוקרים לחשוף את הבסיס המעגלי העומד בבסיס הלמידה האוקולומוטורית.
שתי שיטות לא פולשניות שימשו בעיקר להערכת OKR במחקרים קודמים: (1) וידאו-אוקוקולוגרפיה בשילוב עם תוף פיזי 7,10,11,12,13 או (2) קביעה שרירותית של סיבובי ראש בשילוב עם תוף וירטואלי6,14,15,16. למרות שהיישומים שלהם הניבו תגליות פוריות בהבנת המנגנונים המולקולריים והמעגליים של פלסטיות אוקולומוטורית, לכל שתי שיטות אלה יש כמה חסרונות המגבילים את כוחן בבחינה כמותית של תכונות ה-OKR. ראשית, תופים פיזיים, עם תבניות מודפסות של פסים או נקודות בשחור לבן, אינם מאפשרים שינויים קלים ומהירים של תבניות חזותיות, מה שמגביל במידה רבה את מדידת התלות של ה- OKR בתכונות חזותיות מסוימות, כגון תדירות מרחבית, כיוון וניגודיות של גרגרים נעים 8,17. במקום זאת, בדיקות של הסלקטיביות של OKR לתכונות חזותיות אלה יכולות להפיק תועלת מגירוי חזותי ממוחשב, שבו ניתן לשנות בנוחות תכונות חזותיות מניסוי לניסוי. בדרך זו, חוקרים יכולים לבחון באופן שיטתי את התנהגות OKR במרחב הפרמטרים החזותיים הרב-ממדיים. יתר על כן, השיטה השנייה של בדיקת OKR מדווחת רק על ערכי הסף של פרמטרים חזותיים המפעילים OKR שניתן להבחין בהם, אך לא על המשרעת של תנועות עיניים או ראש 6,14,15,16. היעדר כוח כמותי מונע אפוא ניתוח צורת עקומות הכוונון ותכונות הראייה המועדפות, או איתור הבדלים עדינים בין עכברים בודדים בתנאים נורמליים ופתולוגיים. כדי להתגבר על המגבלות הנ”ל, וידאו-אוקולוגרפיה וגירוי חזותי וירטואלי ממוחשב שולבו כדי להעריך את התנהגות OKR במחקרים אחרונים 5,17,18,19,20. עם זאת, מחקרים אלה שפורסמו בעבר לא סיפקו מספיק פרטים טכניים או הוראות שלב אחר שלב, וכתוצאה מכך זה עדיין מאתגר עבור חוקרים להקים מבחן OKR כזה עבור המחקר שלהם.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות מדויק של סלקטיביות התכונות החזותיות של התנהגות OKR בתנאים פוטופיקליים או סקוטופיים עם שילוב של וידאו-אוקוקולוגרפיה וגירוי חזותי וירטואלי ממוחשב. עכברים מקובעים בראשם כדי למנוע את תנועת העיניים המתעוררת על ידי גירוי שיווי משקל. מצלמה במהירות גבוהה משמשת לתיעוד תנועות העין מעכברים הצופים בגרגרים נעים עם פרמטרים חזותיים משתנים. הגודל הפיזי של גלגלי העיניים של עכברים בודדים מכויל כדי להבטיח את הדיוק של גזירת זווית תנועות העיניים21. שיטה כמותית זו מאפשרת להשוות התנהגות OKR בין בעלי חיים בגילאים שונים או מרקעים גנטיים שונים, או לעקוב אחר השינוי שלה הנגרם על ידי טיפולים תרופתיים או למידה חזותית-מוטורית.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה של הבדיקה ההתנהגותית OKR המוצגת כאן מספקת מספר יתרונות. ראשית, גירוי חזותי שנוצר על ידי מחשב פותר את הבעיות המהותיות של תופים פיזיים. בהתמודדות עם הבעיה שתופים פיזיים אינם תומכים בבחינה שיטתית של תדר, כיוון או כוונון ניגודיות מרחבית8, התוף הווירטואלי מאפשר לשנות פרמטרים ח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ליינגטיאן הא על שיתוף נתוני כוונון הכיוון. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הקנדית לחדשנות וקרן המחקר של אונטריו (פרויקט CFI/ORF מס’ 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) ופרסי Connaught New Research.
Materials
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
References
- Gerhard, D. Neuroscience. 5th Edition. Yale Journal of Biology and Medicine. , (2013).
- Distler, C., Hoffmann, K. P. . The Oxford Handbook of Eye Movement. , 65-83 (2011).
- Sereno, A. B., Bolding, M. S. . Executive Functions: Eye Movements and Human Neurological Disorders. , (2017).
- Giolli, R. A., Blanks, R. H. I., Lui, F. The accessory optic system: basic organization with an update on connectivity, neurochemistry, and function. Progress in Brain Research. 151, 407-440 (2006).
- Liu, B. H., Huberman, A. D., Scanziani, M. Cortico-fugal output from visual cortex promotes plasticity of innate motor behaviour. Nature. 538 (7625), 383-387 (2016).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Stahl, J. S., van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. Journal of Neuroscience Methods. 99 (1-2), 101-110 (2000).
- Faulstich, B. M., Onori, K. A., du Lac, S. Comparison of plasticity and development of mouse optokinetic and vestibulo-ocular reflexes suggests differential gain control mechanisms. Vision Research. 44 (28), 3419-3427 (2004).
- Katoh, A., Kitazawa, H., Itohara, S., Nagao, S. Dynamic characteristics and adaptability of mouse vestibulo-ocular and optokinetic response eye movements and the role of the flocculo-olivary system revealed by chemical lesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (13), 7705-7710 (1998).
- Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), 2055 (2008).
- Cameron, D. J., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (80), 50832 (2013).
- de Jeu, M., De Zeeuw, C. I. Video-oculography in mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3971 (2012).
- Kodama, T., du Lac, S. Adaptive acceleration of visually evoked smooth eye movements in mice. The Journal of Neuroscience. 36 (25), 6836-6849 (2016).
- Doering, C. J., et al. Modified Ca(v)1.4 expression in the Cacna1f(nob2) mouse due to alternative splicing of an ETn inserted in exon 2. PLoS One. 3 (7), e2538 (2008).
- Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708 (2018).
- Waldner, D. M., et al. Transgenic expression of Cacna1f rescues vision and retinal morphology in a mouse model of congenital stationary night blindness 2A (CSNB2A). Translational Vision Science & Technology. 9 (11), 19 (2020).
- Tabata, H., Shimizu, N., Wada, Y., Miura, K., Kawano, K. Initiation of the optokinetic response (OKR) in mice. Journal of Vision. 10 (1), 1-17 (2010).
- Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Current Biology. 32 (19), 4286-4298 (2022).
- Harris, S. C., Dunn, F. A. Asymmetric retinal direction tuning predicts optokinetic eye movements across stimulus conditions. eLife. 12, e81780 (2023).
- van Alphen, B., Winkelman, B. H., Frens, M. A. Three-dimensional optokinetic eye movements in the C57BL/6J mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 623-630 (2010).
- Stahl, J. S. Calcium channelopathy mutants and their role in ocular motor research. Annals of the New York Academy of Sciences. 956, 64-74 (2002).
- Endo, S., et al. Dual involvement of G-substrate in motor learning revealed by gene deletion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (9), 3525-3530 (2009).
- Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
- Burroughs, S. L., Kaja, S., Koulen, P. Quantification of deficits in spatial visual function of mouse models for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3654-3659 (2011).
- Wakita, R., et al. Differential regulations of vestibulo-ocular reflex and optokinetic response by β- and α2-adrenergic receptors in the cerebellar flocculus. Scientific Reports. 7 (1), 3944 (2017).
- Dehmelt, F. A., et al. Spherical arena reveals optokinetic response tuning to stimulus location, size, and frequency across entire visual field of larval zebrafish. eLife. 10, e63355 (2021).
- Magnusson, M., Pyykko, I., Jantti, V. Effect of alertness and visual attention on optokinetic nystagmus in humans. American Journal of Otolaryngology. 6 (6), 419-425 (1985).
- Collins, W. E., Schroeder, D. J., Elam, G. W. Effects of D-amphetamine and of secobarbital on optokinetic and rotation-induced nystagmus. Aviation, Space, and Environmental Medicine. 46 (4), 357-364 (1975).
- Reimer, J., et al. Pupil fluctuations track fast switching of cortical states during quiet wakefulness. Neuron. 84 (2), 355-362 (2014).
- Sakatani, T., Isa, T. PC-based high-speed video-oculography for measuring rapid eye movements in mice. Neuroscience Research. 49 (1), 123-131 (2004).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neuroscience Research. 58 (3), 324-331 (2007).
- Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U., Cardin, J. A. Arousal and locomotion make distinct contributions to cortical activity patterns and visual encoding. Neuron. 86 (3), 740-754 (2015).
- Bradley, M. M., Miccoli, L., Escrig, M. A., Lang, P. J. The pupil as a measure of emotional arousal and autonomic activation. Psychophysiology. 45 (4), 602-607 (2008).
- Hess, E. H., Polt, J. M. Pupil size as related to interest value of visual stimuli. Science. 132 (3423), 349-350 (1960).
- Di Stasi, L. L., Catena, A., Canas, J. J., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S. Saccadic velocity as an arousal index in naturalistic tasks. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (5), 968-975 (2013).
