Cuantificación de la selectividad de las características visuales del reflejo optocinético en ratones
Summary
A continuación, describimos un protocolo estándar para cuantificar el reflejo optocinético. Combina la estimulación virtual de tambores y la video-oculografía, y por lo tanto permite una evaluación precisa de la selectividad de las características del comportamiento y su plasticidad adaptativa.
Abstract
El reflejo optocinético (OKR) es un movimiento ocular innato esencial que se desencadena por el movimiento global del entorno visual y sirve para estabilizar las imágenes de la retina. Debido a su importancia y robustez, el OKR se ha utilizado para estudiar el aprendizaje visomotor y para evaluar las funciones visuales de ratones con diferentes antecedentes genéticos, edades y tratamientos farmacológicos. Aquí, presentamos un procedimiento para evaluar las respuestas OKR de ratones con la cabeza fija con alta precisión. La fijación de la cabeza puede descartar la contribución de la estimulación vestibular a los movimientos oculares, lo que permite medir los movimientos oculares desencadenados solo por el movimiento visual. El OKR es provocado por un sistema de tambor virtual, en el que una rejilla vertical presentada en tres monitores de computadora se desplaza horizontalmente de manera oscilatoria o unidireccional a una velocidad constante. Con este sistema de realidad virtual, podemos cambiar sistemáticamente parámetros visuales como la frecuencia espacial, la frecuencia temporal/oscilación, el contraste, la luminancia y la dirección de las rejillas, y cuantificar las curvas de sintonización de la selectividad de las características visuales. La videooculografía infrarroja de alta velocidad garantiza una medición precisa de la trayectoria de los movimientos oculares. Los ojos de ratones individuales se calibran para brindar oportunidades para comparar los OKR entre animales de diferentes edades, géneros y antecedentes genéticos. El poder cuantitativo de esta técnica le permite detectar cambios en el OKR cuando este comportamiento se adapta plásticamente debido al envejecimiento, la experiencia sensorial o el aprendizaje motor; Por lo tanto, hace que esta técnica sea una valiosa adición al repertorio de herramientas utilizadas para investigar la plasticidad de los comportamientos oculares.
Introduction
En respuesta a los estímulos visuales del entorno, nuestros ojos se mueven para desplazar la mirada, estabilizar las imágenes de la retina, rastrear objetivos en movimiento o alinear las fóveas de dos ojos con objetivos situados a diferentes distancias del observador, que son vitales para una visión adecuada 1,2. Las conductas oculomotoras han sido ampliamente utilizadas como modelos atractivos de integración sensoriomotora para comprender los circuitos neuronales en la salud y la enfermedad, al menos en parte debido a la simplicidad del sistema oculomotor3. Controlado por tres pares de músculos extraoculares, el ojo rota en la cavidad principalmente alrededor de tres ejes correspondientes: elevación y depresión a lo largo del eje transversal, aducción y abducción a lo largo del eje vertical, e intorsión y extorsión a lo largo del eje anteroposterior 1,2. Un sistema tan simple permite a los investigadores evaluar los comportamientos oculomotores de los ratones de manera fácil y precisa en un entorno de laboratorio.
Uno de los principales comportamientos oculomotores es el reflejo optocinético (OKR). Este movimiento ocular involuntario se desencadena por desplazamientos lentos o deslizamientos de imágenes en la retina y sirve para estabilizar las imágenes retinianas a medida que la cabeza de un animal o su entorno se mueven 2,4. El OKR, como paradigma conductual, es interesante para los investigadores por varias razones. En primer lugar, puede ser estimulado de forma fiable y cuantificado con precisión 5,6. En segundo lugar, los procedimientos para cuantificar este comportamiento son relativamente simples y estandarizados y pueden aplicarse para evaluar las funciones visuales de una gran cohorte de animales7. En tercer lugar, este comportamiento innato es altamente plástico 5,8,9. Su amplitud puede ser potenciada cuando se producen deslizamientos repetitivos de la retina durante mucho tiempo 5,8,9, o cuando su compañero de trabajo, el reflejo ocular vestibular (VOR), otro mecanismo de estabilización de las imágenes retinianas desencadenado por la entrada vestibular2, se ve afectado5. Estos paradigmas experimentales de potenciación de OKR permiten a los investigadores desvelar la base del circuito que subyace al aprendizaje oculomotor.
En estudios previos se han utilizado principalmente dos métodos no invasivos para evaluar el OKR: (1) video-oculografía combinada con un tambor físico 7,10,11,12,13 o (2) determinación arbitraria de los giros de cabeza combinados con un tambor virtual6,14,15,16. Aunque sus aplicaciones han hecho descubrimientos fructíferos en la comprensión de los mecanismos moleculares y de circuitos de la plasticidad oculomotora, estos dos métodos tienen algunos inconvenientes que limitan sus poderes para examinar cuantitativamente las propiedades del OKR. En primer lugar, los tambores físicos, con patrones impresos de rayas o puntos blancos y negros, no permiten cambios fáciles y rápidos de patrones visuales, lo que restringe en gran medida la medición de la dependencia del OKR de ciertas características visuales, como la frecuencia espacial, la dirección y el contraste de las rejillas móviles 8,17. En cambio, las pruebas de la selectividad del OKR a estas características visuales pueden beneficiarse de la estimulación visual computarizada, en la que las características visuales pueden modificarse convenientemente de un ensayo a otro. De esta manera, los investigadores pueden examinar sistemáticamente el comportamiento de los OKR en el espacio de parámetros visuales multidimensionales. Además, el segundo método del ensayo OKR informa solo de los umbrales de los parámetros visuales que activan los OKR discernibles, pero no de las amplitudes de los movimientos oculares o de la cabeza 6,14,15,16. Por lo tanto, la falta de potencia cuantitativa impide analizar la forma de las curvas de sintonía y las características visuales preferidas, o detectar diferencias sutiles entre ratones individuales en condiciones normales y patológicas. Para superar las limitaciones anteriores, la video-oculografía y la estimulación visual virtual computarizada se combinaron para ensayar el comportamiento de OKR en estudios recientes 5,17,18,19,20. Sin embargo, estos estudios publicados anteriormente no proporcionaron suficientes detalles técnicos o instrucciones paso a paso y, en consecuencia, sigue siendo un desafío para los investigadores establecer una prueba de OKR de este tipo para su propia investigación.
Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión la selectividad de las características visuales del comportamiento de OKR en condiciones fotópicas o escotópicas con la combinación de video-oculografía y estimulación visual virtual computarizada. Los ratones están fijados a la cabeza para evitar el movimiento ocular evocado por la estimulación vestibular. Se utiliza una cámara de alta velocidad para registrar los movimientos oculares de los ratones que observan rejillas en movimiento con parámetros visuales cambiantes. El tamaño físico de los globos oculares de ratones individuales se calibra para garantizar la precisión de la derivación del ángulo de los movimientos oculares21. Este método cuantitativo permite comparar el comportamiento de OKR entre animales de diferentes edades o antecedentes genéticos, o monitorizar su cambio causado por tratamientos farmacológicos o aprendizaje visomotor.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método del ensayo de comportamiento OKR que se presenta aquí ofrece varias ventajas. En primer lugar, la estimulación visual generada por ordenador resuelve los problemas intrínsecos de los tambores físicos. Teniendo en cuenta el problema de que los tambores físicos no admiten el examen sistemático de la frecuencia espacial, la dirección o la sintonización del contraste8, el tambor virtual permite cambiar estos parámetros visuales ensayo por ensayo, lo que facilita un análisis sistem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a Yingtian He por compartir datos de ajuste de dirección. Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Canadiense de Innovación y el Fondo de Investigación de Ontario (proyecto CFI/ORF n.º 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) y Connaught New Researcher Awards.
Materials
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
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