التروية الدموية السريعة الفعالة في Xenopus
Summary
يظهر هنا بروتوكول فعال لنضح الدم السريع لإعداد عينات الأنسجة من الضفادع الأفريقية ذات المخالب لدراسات النسخ والبروتينات.
Abstract
كانت Xenopus كائنات نموذجية قوية لفهم تطور الفقاريات وأمراضها لأكثر من 100 عام. هنا ، يتم تعريف بروتوكول نضح الدم السريع في Xenopus ، والذي يهدف إلى انخفاض ثابت وجذري للدم داخل جميع الأنسجة. يتم إجراء التروية عن طريق إدخال إبرة مباشرة في بطين القلب وضخ محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عبر نظام الأوعية الدموية. يمكن إكمال الإجراء في حوالي 10 دقائق لكل. يهيمن على الدم عدد قليل من البروتينات وأنواع الخلايا الوفيرة للغاية ، مما يخلق العديد من المشكلات لأن هذه البروتينات تخفي معظم الجزيئات وأنواع الخلايا الأخرى ذات الأهمية. سيستفيد التوصيف القابل للتكرار لأنسجة Xenopus البالغة مع البروتينات الكمية والنسخ أحادي الخلية من تطبيق هذا البروتوكول قبل أخذ عينات الأعضاء. يتم تعريف بروتوكولات أخذ عينات الأنسجة في الأوراق المصاحبة. تهدف هذه الإجراءات إلى توحيد الممارسات عبر Xenopus من مختلف الجنس والعمر والحالة الصحية ، وتحديدا X. laevis و X. tropicalis.
Introduction
يتم الانتهاء من نضح البرمائيات بالكامل بشكل روتيني لأغراض الحفظ والتثبيت1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، تحدث هذه الإجراءات بمعدل يحد من عدد العينات الطازجة التي يمكن أخذها لكل. الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول فعال لنضح الدم في Xenopus ، مع إعطاء الأولوية لسرعة هذه التقنية. يستغرق البروتوكول أقل من 10 دقائق لكل ل X. tropicalis وأقل من 15 دقيقة لكل X. laevis. الأولويات الثانوية هي سهولة النسخ واستخدام المعدات التي يمكن الحصول عليها بسهولة بحيث يمكن مشاركة العينات عالية الجودة على نطاق واسع بين مختبرات Xenopus.
تستخدم ضفادع Xenopus على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لدراسة العمليات البيولوجية والمرضية الأساسية المحفوظة عبر الأنواع. هذا رباعي الأرجل له علاقة تطورية أوثق مع الثدييات من النماذج المائية الأخرى ، حيث يحتوي على رئتين وقلب من ثلاث غرف وأطراف ذات أرقام. يستخدم المجتمع الدولي Xenopus بشكل فعال لاكتساب فهم أعمق للأمراض البشرية من خلال نمذجة الأمراض المتعمقة والتحليل الجزيئي لوظيفة الجينات المرتبطة بالمرض. المزايا العديدة ل Xenopus كنموذج حيواني تجعلها أدوات لا تقدر بثمن لدراسة الأساس الجزيئي للتنمية البشرية والمرض. وتشمل هذه المزايا: حجم البويضة والجنين الكبير ، والخصوبة العالية ، وسهولة السكن ، والتطور الخارجي السريع ، وسهولة التلاعب الجينومي. تشير التقديرات إلى أن Xenopus يشارك ~ 80٪ من جينات الأمراض البشرية المحددة7.
بالمقارنة مع نماذج الثدييات الشائعة ، يعد Xenopus نموذجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة ، مع سهولة هدم المورفولينو وتوافر الجينات المحورة الفعالة والطفرات الجينية المستهدفة باستخدام CRISPR8. تم تطبيق قياس الطيف الكتلي الكمي والنسخ أحادي الخلية بنجاح على أجنة Xenopus 9,10 ، لكن أطلس الخلايا الأخير من Xenopus laevis يظهر أن تكوين معظم الأنسجة تهيمن عليه أنواع خلايا الدم 11. من خلال تطوير تقنية تقوم بإخراج الأنسجة بمعدل سريع واستخدام الوسائط المبردة ، تتأثر نضارة العينة إلى الحد الأدنى بالتروية. هذا مهم بشكل خاص للتطبيقات التي يكون الهدف فيها هو تحديد mRNA غير المضطرب من الناحية الفسيولوجية أو تعبير البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول تقنيات التشريح التقليدية للوصول إلى تجويف coelomic. التقنيات الأخرى مقبولة أيضا ، بشرط أن تسبب الحد الأدنى من الضرر للأنسجة ، ويمكن الوصول إلى القلب ، وتكون الرئة والمعدة مرئية. وبالمثل ، يمكن استبدال معظم أدوات التشريح المدرجة بسهولة بعناصر قابلة للمقارنة.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة OD R24 التابعة للمعاهد الوطنية للصحة OD031956 ومنحة NICHD R01 HD073104. نشكر دارسي كيلي على المناقشات المفيدة والمدخلات الأولية حول هذا البروتوكول. نود أيضا أن نشكر سامانثا جالبرت وجيل رالستون وويل راتزان على مساعدتهم ودعمهم بالإضافة إلى المراجعين النظراء الثلاثة المجهولين على ملاحظاتهم.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
