Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus
Summary
Presentato qui è un efficace protocollo di perfusione sanguigna rapida per preparare campioni di tessuto da rane artigliate africane per studi di trascrittomica e proteomica.
Abstract
Gli xenopus sono stati potenti organismi modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre 100 anni. Qui viene definito un protocollo di perfusione sanguigna rapida in Xenopus, volto a una riduzione costante e drastica del sangue all’interno di tutti i tessuti. La perfusione viene effettuata inserendo un ago direttamente nel ventricolo del cuore e pompando soluzione salina eparinizzata tamponata fosfato (PBS) attraverso il sistema vascolare. La procedura può essere completata in circa 10 minuti per animale. Il sangue è dominato da poche proteine e tipi di cellule molto abbondanti, creando numerosi problemi poiché queste proteine mascherano la maggior parte delle altre molecole e tipi di cellule di interesse. La caratterizzazione riproducibile di tessuti adulti di Xenopus con proteomica quantitativa e trascrittomica monocellulare trarrà beneficio dall’applicazione di questo protocollo prima del prelievo d’organo. I protocolli per il campionamento dei tessuti sono definiti in documenti di accompagnamento. Queste procedure mirano alla standardizzazione delle pratiche in Xenopus di diverso sesso, età e stato di salute, in particolare X. laevis e X. tropicalis.
Introduction
La perfusione di anfibi su tutto il corpo viene regolarmente completata ai fini della conservazione e della fissazione 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, queste procedure avvengono a una velocità che limita il numero di campioni freschi che possono essere prelevati per animale. L’obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un protocollo di perfusione sanguigna efficace in Xenopus, dando priorità alla velocità della tecnica. Il protocollo richiede meno di 10 minuti per animale per X. tropicalis e meno di 15 minuti per X. laevis animale. Le priorità secondarie sono la facilità di replica e l’uso di apparecchiature facilmente acquisibili in modo che i campioni di alta qualità possano essere ampiamente condivisi tra i laboratori Xenopus.
Le rane Xenopus sono ampiamente utilizzate nella ricerca biomedica per studiare i processi biologici e patologici fondamentali conservati tra le specie. Questo tetrapode ha una relazione evolutiva più stretta con i mammiferi rispetto ad altri modelli acquatici, avendo polmoni, un cuore a tre camere e arti con dita. La comunità internazionale utilizza efficacemente Xenopus per ottenere una comprensione più profonda delle malattie umane attraverso modelli approfonditi della malattia e analisi molecolare della funzione genica correlata alla malattia. I numerosi vantaggi di Xenopus come modello animale li rendono strumenti inestimabili per studiare le basi molecolari dello sviluppo umano e delle malattie; Questi vantaggi includono: grandi dimensioni di ovociti ed embrioni, alta fecondità, facilità di alloggiamento, rapido sviluppo esterno e facilità di manipolazione genomica. È stato stimato che Xenopus condivida ~ 80% dei geni della malattia umana identificati7.
Rispetto ai modelli di mammiferi popolari, Xenopus è un modello rapido ed economico, con la facilità di abbattimento del morfolino e la disponibilità di transgenici efficienti e mutazioni genetiche mirate utilizzando CRISPR8. La spettrometria di massa quantitativa e la trascrittomica monocellulare sono state applicate con successo agli embrioni di Xenopus9,10, ma un recente atlante cellulare di Xenopus laevis mostra che la composizione della maggior parte dei tessuti è dominata dai tipi di cellule del sangue 11. Sviluppando una tecnica che dissangua il tessuto a un ritmo rapido e utilizzando mezzi refrigerati, la freschezza del campione è minimamente influenzata dalla perfusione. Ciò è particolarmente importante per le applicazioni in cui l’obiettivo è quello di profilare l’espressione fisiologicamente imperturbata di mRNA o proteine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive le tecniche tradizionali di dissezione per accedere alla cavità celomica. Anche altre tecniche sono accettabili, a condizione che causino danni minimi ai tessuti, che il cuore sia accessibile e che il polmone e lo stomaco siano visibili. Allo stesso modo, la maggior parte degli strumenti di dissezione elencati può essere facilmente sostituita con elementi comparabili.
Mentre sono stati fatti tentativi per ottimizzare l’efficacia di questa procedura, i risultati pos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal OD031956 di sovvenzione OD R24 del NIH e dal HD073104 della sovvenzione NICHD R01. Ringraziamo Darcy Kelly per le utili discussioni e gli input iniziali su questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare Samantha Jalbert, Jill Ralston e Wil Ratzan per la loro assistenza e supporto, nonché i nostri tre revisori anonimi per il loro feedback.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
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