Optimering af ydeevneparametre for TAGGG Telomere Length Assay
Summary
Her beskriver vi detaljeret protokollen til kvantificering af telomerlængde ved hjælp af ikke-radioaktiv kemiluminescensdetektion med fokus på optimering af forskellige ydelsesparametre for TAGGG telomerlængdeanalysesættet, såsom buffermængder og sondekoncentrationer.
Abstract
Telomerer er gentagne sekvenser, der er til stede i kromosomale ender; Deres forkortelse er et karakteristisk træk ved humane somatiske celler. Forkortelse opstår på grund af et problem med endereplikation og fraværet af telomeraseenzymet, som er ansvarlig for at opretholde telomerlængden. Interessant nok forkortes telomerer også som reaktion på forskellige interne fysiologiske processer, som oxidativ stress og betændelse, som kan blive påvirket på grund af ekstracellulære midler som forurenende stoffer, infektiøse stoffer, næringsstoffer eller stråling. Således tjener telomerlængden som en fremragende biomarkør for aldring og forskellige fysiologiske sundhedsparametre. TAGGG telomerlængdeanalysesættet bruges til at kvantificere gennemsnitlige telomerlængder ved hjælp af telomerrestriktionsfragmentet (TRF) assay og er meget reproducerbart. Det er dog en dyr metode, og på grund af dette anvendes den ikke rutinemæssigt til store stikprøvenumre. Her beskriver vi en detaljeret protokol for en optimeret og omkostningseffektiv måling af telomerlængde ved hjælp af Southern blots eller TRF-analyse og ikke-radioaktiv kemiluminescensbaseret detektion.
Introduction
Telomerer er de gentagne DNA-sekvenser, der er til stede i slutningen af kromosomer. De har tandemgentagelser af TTAGGG og opretholder genomintegritet ved at beskytte kromosomet mod både flossning og slutreplikationsproblemet, hvilket betyder, at en del af 3′-udhænget ikke kan replikeres af DNA-polymerase 1,2. Korte telomerer fører til kromosomale abnormiteter i celler, på grund af hvilke celler bliver permanent arresteret i et stadium kaldet replikativ ældning3. Korte telomerer forårsager også en lang række andre problemer, såsom mitokondrier dysfunktion 4,5 og celledysfunktion.
DNA-telomeriske gentagelser går tabt, når og når cellen deler sig, med et gennemsnitligt tab på 25 til 200 bp pr. år 6, hvilket resulterer i cellulær ældning efter et vist antal divisioner6. Aldring er forbundet med en højere frekvens af comorbiditeter, hvilket er præget af en forkortelse i telomerlængde7. Telomerrestriktionsfragment (TRF) analyse, som beskrevet af Mender, er en meget dyr metode8. På grund af dette implementeres det ikke, mens telomerlængden kvantificeres i de fleste undersøgelser.
I øjeblikket anvender de fleste epidemiologiske undersøgelser kvantitative polymerasekædereaktionsbaserede (qPCR) -baserede målinger af telomerlængde. Den qPCR-baserede metode er imidlertid en relativ målemetode, da den måler forholdet mellem telomerer og enkeltkopi-genamplifikationsprodukter og ikke absolut telomerlængde. Telomerlængdemåling ved hjælp af TRF-protokollen er guldstandardmetoden, da den kan måle telomerlængdefordeling i prøven, og målinger kan udtrykkes i absolutte værdier i kilobaser (kb). Imidlertid er brugen begrænset, fordi det er besværligt, arbejdskrævende og dyrt. Her præsenterer vi en optimeret protokol til telomerlængdemåling ved hjælp af kemiluminescensbaserede TRF’er.
TRF-analyse inkluderer syv hovedtrin: 1) dyrkning af celler til genomisk DNA-ekstraktion, 2) genomisk DNA-ekstraktion ved hjælp af phenol: chloroform: isoamylalkohol (P: C: I) -metoden, 3) restriktionsfordøjelse af genomisk DNA, 4) agarosegelelektroforese, 5) Southern blotting af restriktionsfordøjelses-DNA-fragmentet, 6) hybridisering og detektion via Chemiluminescens-Den immobiliserede telomersonde visualiseres af et meget følsomt kemiluminescerende substrat til alkalisk phosphatase, dinatrium-2-chlor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2′-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-phenylphosphat (CDP-Star)-og 7) analyse for at opnå gennemsnitlig telomerlængde og rækkeviddeinformation fra disse telomeriske udstrygninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en detaljeret procedure for en ikke-radioaktiv, kemiluminescensbaseret metode til telomerlængdemåling ved hjælp af Southern blotting. Protokollen er blevet testet for at tillade fornuftig brug af flere reagenser uden at gå på kompromis med kvaliteten af resultaterne. Prehybridiserings- og hybridiseringsbufferen kan genbruges op til fem gange. Enzymkoncentrationen kan variere mellem 10-20 U pr. 1,5-2 μg genomisk DNA uden at påvirke resultaterne. Flere andre kitkomponenter, såsom den DIG-mærkede molek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke fru Prachi Shah for at hjælpe os i første omgang med protokoloptimeringen. Vi vil gerne takke Dr. Manoj Garg for at levere A2780 ovariecancercellelinjen. EK er støttet af en forskningsbevilling fra Institut for Bioteknologi (nr. BT/RLF/Re-entry/06/2015), Institut for Naturvidenskab og Teknologi (ECR/2018/002117) og NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt’s lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat’s skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
