टीएजीजीजी टेलोमेरे लंबाई परख के प्रदर्शन मापदंडों का अनुकूलन
Summary
यहां, हम गैर-रेडियोधर्मी केमिल्यूमिनेसेंट डिटेक्शन का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई को निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं, जिसमें टीएजीजीजी टेलोमेयर लंबाई परख किट के विभिन्न प्रदर्शन मापदंडों के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया जाता है, जैसे कि बफर मात्रा और जांच सांद्रता।
Abstract
टेलोमेरेस दोहराए जाने वाले अनुक्रम हैं जो क्रोमोसोमल सिरों पर मौजूद हैं; उनका छोटा होना मानव दैहिक कोशिकाओं की एक विशिष्ट विशेषता है। अंत प्रतिकृति के साथ एक समस्या और टेलोमेरेज़ एंजाइम की अनुपस्थिति के कारण छोटा होना होता है, जो टेलोमेयर की लंबाई को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार है। दिलचस्प बात यह है कि टेलोमेरेस विभिन्न आंतरिक शारीरिक प्रक्रियाओं के जवाब में भी कम हो जाते हैं, जैसे ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन, जो प्रदूषकों, संक्रामक एजेंटों, पोषक तत्वों या विकिरण जैसे बाह्य एजेंटों के कारण प्रभावित हो सकते हैं। इस प्रकार, टेलोमेयर की लंबाई उम्र बढ़ने और विभिन्न शारीरिक स्वास्थ्य मापदंडों के एक उत्कृष्ट बायोमार्कर के रूप में कार्य करती है। टीएजीजीजी टेलोमेयर लंबाई परख किट का उपयोग टेलोमेयर प्रतिबंध खंड (टीआरएफ) परख का उपयोग करके औसत टेलोमेयर लंबाई को मापने के लिए किया जाता है और यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। हालांकि, यह एक महंगी विधि है, और इस वजह से, यह बड़ी नमूना संख्या के लिए नियमित रूप से नियोजित नहीं है। यहां, हम दक्षिणी ब्लॉट्स या टीआरएफ विश्लेषण और गैर-रेडियोधर्मी केमिल्यूमिनेसेंस-आधारित पहचान का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई के अनुकूलित और लागत प्रभावी माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Introduction
टेलोमेरेस गुणसूत्रों के अंत में मौजूद दोहराए जाने वाले डीएनए अनुक्रम हैं। उनके पास टीटीएजीजीजी के अग्रानुक्रम दोहराव हैं और क्रोमोसोम को फ्रैइंग और अंतिम प्रतिकृति समस्या दोनों से बचाकर जीनोम अखंडता बनाए रखते हैं, जिसका अर्थ है कि 3 ‘ओवरहैंग का हिस्सा डीएनए पोलीमरेज़ 1,2 द्वारा दोहराया जाने में असमर्थ है। छोटे टेलोमेरेस कोशिकाओं में क्रोमोसोमल असामान्यताएं पैदा करते हैं, जिसके कारण कोशिकाएं प्रतिकृति सेनेसेंस3 नामक एक चरण में स्थायी रूप से गिरफ्तार हो जाती हैं। छोटे टेलोमेरेस अन्य समस्याओं की मेजबानी भी करते हैं, जैसे माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन 4,5 और सेल डिसफंक्शन।
डीएनए टेलोमेरिक दोहराव खो जाता है जब कोशिका विभाजित होती है,प्रति वर्ष 25 से 200 बीपी की औसत हानि के साथ, जिसके परिणामस्वरूप एक निश्चित संख्या में विभाजन6 के बाद सेलुलर शिथिलता होती है। उम्र बढ़ने को कोमोर्बिडिटी की उच्च आवृत्ति के साथ जोड़ा जाता है, जिसे टेलोमेयर लंबाई7 में कमी द्वारा चिह्नित किया जाता है। टेलोमेयर प्रतिबंध टुकड़ा (टीआरएफ) विश्लेषण, जैसा कि मेंडर द्वारा वर्णित है, एक बहुत ही महंगी विधिहै। इस वजह से, अधिकांश अध्ययनों में टेलोमेयर की लंबाई को निर्धारित करते समय इसे लागू नहीं किया जाता है।
वर्तमान में, महामारी विज्ञान के अधिकांश अध्ययन टेलोमेयर लंबाई के मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) -आधारित माप को नियोजित करते हैं। हालांकि, क्यूपीसीआर-आधारित विधि एक सापेक्ष माप विधि है, क्योंकि यह टेलोमेरेस और एकल-प्रतिलिपि जीन प्रवर्धन उत्पादों के बीच अनुपात को मापता है, न कि पूर्ण टेलोमेयर लंबाई। टीआरएफ प्रोटोकॉल का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई माप सोने की मानक विधि है, क्योंकि यह नमूने में टेलोमेयर लंबाई वितरण को माप सकता है और माप को किलोबेस (केबी) में पूर्ण मूल्यों में व्यक्त किया जा सकता है। हालांकि, इसका उपयोग सीमित है क्योंकि यह बोझिल, श्रम-गहन और महंगा है। यहां, हम केमिल्यूमिनेसेंस-आधारित टीआरएफ का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई माप के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
टीआरएफ विश्लेषण में सात प्रमुख चरण शामिल हैं: 1) जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं का संवर्धन, 2) फिनोल का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिलअल्कोहल (पी: सी: आई) विधि, 3) जीनोमिक डीएनए का प्रतिबंध पाचन, 4) एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन, 5) प्रतिबंध पाचन डीएनए टुकड़े का दक्षिणी सोख्ता, 6) संकरण और पता लगाने के माध्यम से केमिल्यूमिनेसेंस- स्थिर टेलोमेयर जांच को क्षारीय फॉस्फेट के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील केमिलिमिनसेंट सब्सट्रेट द्वारा देखा जाता है, डाइसोडियम 2-क्लोरो-5-(4-मेथॉक्सीस्पाइरो[1,2-डायोक्सेटेन-3,2′-(5-क्लोरोट्राइसाइक्लो[3.3.1.13.7]डेकान)-4-वाईएल]-1-फिनाइल फॉस्फेट (सीडीपी-स्टार)-और 7) विश्लेषण इन टेलोमेरिक स्मीयर से औसत टेलोमेयर लंबाई और रेंज जानकारी प्राप्त करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम दक्षिणी सोख्ता का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई माप के लिए एक गैर-रेडियोधर्मी, केमिल्यूमिनेसेंस-आधारित विधि के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल का परीक्षण कई अभिकर्मकों के विवेक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रोटोकॉल अनुकूलन के साथ शुरू में हमारी मदद करने के लिए सुश्री प्राची शाह को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम ए 2780 डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन प्रदान करने के लिए डॉ मनोज गर्ग को धन्यवाद देना चाहते हैं। ईके को जैव प्रौद्योगिकी विभाग (संख्या बीटी/आरएलएफ/री-एंट्री/06/2015), विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (ईसीआर/2018/002117), और एनएमआईएमएस बीज अनुदान (आईओ 401405) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित है।
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
References
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt’s lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat’s skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
