O protocolo descreve como esferas de compensação à base de porfirina para citometria de fluxo são preparadas pela reação de esferas de poliestireno funcionalizadas com amina com a porfirina TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC. Um procedimento de filtração é usado para reduzir os subprodutos particulados.
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Artigo de método
Pérolas Modificadas com Porfirina para Uso como Controle de Compensação em Citometria de Fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A citometria de fluxo pode caracterizar e quantificar rapidamente diversas populações celulares com base em medidas de fluorescência. As células são primeiramente coradas com um ou mais reagentes fluorescentes, cada um funcionalizado com uma molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se liga às células seletivamente com base em suas características fenotípicas, como a expressão de antígenos de superfície celular. A intensidade de fluorescência de cada reagente ligado às células pode ser medida no citômetro de fluxo usando canais que detectam uma faixa especificada de comprimentos de onda. Quando múltiplos fluoróforos são usados, a luz de fluoróforos individuais geralmente transborda para canais de detecção indesejados, o que requer uma correção nos dados de intensidade de fluorescência em um processo chamado compensação.
Partículas de controle de compensação, tipicamente esferas de polímero ligadas a um único fluoróforo, são necessárias para cada fluoróforo usado em um experimento de marcação celular. Os dados das partículas de compensação do citômetro de fluxo são usados para aplicar uma correção nas medidas de intensidade de fluorescência. Este protocolo descreve a preparação e purificação de esferas de compensação de poliestireno funcionalizadas covalentemente com o reagente fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) e sua aplicação na compensação por citometria de fluxo. Neste trabalho, esferas de poliestireno funcionalizadas com amina foram tratadas com TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC (cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) em pH 6 e à temperatura ambiente por 16 h com agitação. As esferas de TCPP foram isoladas por centrifugação e ressuspensas em tampão pH 7 para armazenamento. Partículas relacionadas ao TCPP foram observadas como subproduto. O número dessas partículas poderia ser reduzido usando um protocolo de filtração opcional. As esferas TCPP resultantes foram usadas com sucesso em um citômetro de fluxo para compensação em experimentos com células de escarro humano marcadas com múltiplos fluoróforos. As esferas de TCPP mostraram-se estáveis após armazenamento em geladeira por 300 dias.
Introdução
As porfirinas têm sido de interesse há muitos anos na área biomédica devido às suas propriedades fluorescentes e de direcionamento tumoral 1,2,3. Aplicações terapêuticas como a terapia fotodinâmica (TFD) e a terapia sonodinâmica (TSD) envolvem a administração sistêmica de uma porfirina a um paciente com câncer, o acúmulo da droga no tumor e a exposição localizada do tumor a uma luz laser de um comprimento de onda específico ou ultrassom. A exposição à luz laser ou ao ultrassom leva à geração de espécies reativas de oxigênio pela porfirina e subsequente morte celular
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Protocolo
Todos os procedimentos precisam ser feitos com equipamentos de proteção individual adequados.
1. Preparo da solução-estoque de TCPP, 1,0 mg/mL
NOTA: Isso pode ser preparado mensalmente.
- Usando uma balança analítica, espátula e papel de pesagem, pesar 49,0-50,9 mg de TCPP. Arredondar o peso para 1/10 de miligrama. Separe a quantidade medida de TCPP protegida da luz.
Observação : use uma arma estática se a leitura de peso é instável. - Determinar as quantidades necessárias de água purificada e isopropanol (IPA) da Tabela 1 com base na quantidade de TCPP pesada ....
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Resultados
Este protocolo para a marcação TCPP de contas é relativamente rápido e eficiente. A Figura 1 mostra um resultado representativo do processo de marcação de esferas TCPP determinado por citometria de fluxo. A Figura 1A mostra o perfil padronizado das contas Rainbow, conforme detectado no canal apropriado para detecção de TCPP. Essas esferas servem como um QC para a padronização das tensões do laser para a detecção de TCPP pelo citômetro de fluxo.
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Discussão
Apesar das inúmeras aplicações das porfirinas no diagnóstico e terapêutica docâncer2, há pouca literatura sobre seu potencial uso como reagente de citometria de fluxo para a identificação de populações de células cancerosas versus não cancerosas em tecidos humanos primários24,25,26. Nossa pesquisa na análise por citometria de fluxo do escarro humano24,27
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Divulgações
Todos os autores são funcionários da bioAffinity Technologies.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a David Rodriguez pela assistência com a preparação da figura e Serviços de Patologia de Precisão (San Antonio, TX) pelo uso de seu citômetro de fluxo Navios EX.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Frascos de plástico âmbar, 2 mL, fundo em U, polipropileno | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Esferas de poliestireno divinilbenzeno reticuladas com amina (PS/DVB), 10,6 μ m de diâmetro, 2,5% p/v suspensão aquosa, 3,82 x 107 contas/mL, 7,11 x 1011 amine/grânulo | Spherotech | APX-100-10 | Diâmetro spec. 8,0-12,9 um, suspensão 2,5% c/v 3,82 x 107 grânulos/mL, 7,11 x 1011 grupos aminas/grânulos |
| Tubos cônicos, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrífuga | com rotor apropriado | ||
| Garrafa descartável de poliestireno com tampa, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimetilaminopropil)- N'- cloridrato de etilcarbodiimida), ≥ 98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Software de Análise de Célula Única (v10.6.1) | BD | ||
| Lamínulas de vidro, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Filtros de seringa de fibra de vidro (Finneran, 5 µ m, 13 mm de diâmetro) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Lâminas de microscópio de vidro, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Solução salina balanceada (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, grau ACS | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Pipeta mecânica, 1 canal, 100-1000 uL com pontas | Eppendorf | ||
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ácido etanossulfônico, sal hemissódico | Sigma | M0164 | Nº CAS: 117961-21-4 |
| Citômetro de fluxo Navios EX | Beckman Coulter | ||
| Microscópio Olympus BX-40 com câmera DP73 e objetiva 40X com software cellSens | Olympus | ou pipetas Pasteur | |
| similares, vidro, 5.75" | Fisher Medidor | 13-678-6B | |
| (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| , 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Partículas de poliestireno (não funcionalizadas), SPHERO, 2,5% w/v, 8,0-12,9 µ m | Spherotech | PP-100-10 | |
| Tubos de polipropileno, 15mL, cônicos | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Tubos de poliestireno, fundo redondo | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Pipetas sorológicas, descartáveis - 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Pipetas sorológicas, descartáveis - 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma | S6014 | Nº CAS: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxifenil)porfina) Fronteira Científica | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Leitor de Placa de Faísca Tecan (ou similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tubo revólver/rotador | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Misturador Vortex | Fisher Scientific | 2215365 |
Referências
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as d....
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Reimpressões e permissões
