Kroniska sår som är resistenta mot antibiotika är ett stort hot mot sjukvården. Biofilminfektioner är envisa och fientliga och kan orsaka bristfällig funktionell sårförslutning. Vi rapporterar en kliniskt relevant svinmodell av biofilminfekterade kroniska fullhudssår. Denna modell är kraftfull för mekanistiska studier såväl som för att testa interventioner.
Biofilminfektion är en viktig bidragande orsak till sårkronicitet. Etableringen av kliniskt relevant experimentell sårbiofilminfektion kräver involvering av värdens immunsystem. Iterativa förändringar i värden och patogenen under bildandet av sådan kliniskt relevant biofilm kan endast inträffa in vivo. Svinsårmodellen är erkänd för sina fördelar som en kraftfull preklinisk modell. Det finns flera rapporterade metoder för att studera sårbiofilmer. In vitro – och ex vivo-system är bristfälliga när det gäller värdens immunsvar. Korttidsstudier in vivo innebär akuta reaktioner och tillåter därför inte biofilmsmognad, vilket är känt för att ske kliniskt. Den första långtidsstudien av svinsår rapporterades 2014. Studien erkände att biofilminfekterade sår kan stängas enligt planimetry, men hudbarriärfunktionen på det drabbade stället kan misslyckas med att återställas. Senare validerades denna observation kliniskt. Konceptet med funktionell sårförslutning var därmed fött. Sår som är stängda men som har brister i hudens barriärfunktion kan ses som osynliga sår. I detta arbete strävar vi efter att rapportera de metodologiska detaljer som är nödvändiga för att reproducera den långsiktiga svinmodellen av biofilminfekterad svår brännskada, vilket är kliniskt relevant och har translationellt värde. Detta protokoll ger detaljerad vägledning om hur man etablerar en 8 veckors sårbiofilminfektion med P . aeruginosa (PA01). Åtta fullhudsbrännskador skapades symmetriskt på ryggen hos tama vita grisar, som inokulerades med (PA01) dag 3 efter brännskada; Därefter utfördes icke-invasiva bedömningar av sårläkningen vid olika tidpunkter med hjälp av laserspeckelavbildning (LSI), högupplöst ultraljud (HUSD) och transepidermal vattenförlust (TEWL). De inokulerade brännskadorna täcktes med ett förband i fyra lager. Biofilmer, som etablerats och bekräftats strukturellt av SEM på dag 7 efter inokulering, äventyrade den funktionella sårförslutningen. Ett sådant negativt resultat kan upphävas som svar på lämpliga åtgärder.
Biofilminfektion komplicerar brännskador och kroniska sår och orsakar kronicitet 1,2,3,4,5. Inom mikrobiologin studeras i första hand biofilmens mekanismer, med fokus på mikroberna 1,6. Lärdomarna från dessa studier är av största vikt ur en biologisk vetenskaplig synvinkel men behöver inte nödvändigtvis vara tillämpliga på kliniskt relevanta patogena biofilmer 6,7,8. Kliniskt relevanta strukturella aggregat för biofilm bör inkludera mikrobiella såväl som värdfaktorer 8,9,10. En sådan mikromiljö gör det möjligt att inkludera iterativa interaktioner mellan värd och mikrob, vilket är avgörande för att utveckla en kliniskt relevant biofilm 7,8. I en sådan process är deltagandet av immunceller och blodburna faktorer avgörande11,12. De interaktioner mellan värd och mikrober som ligger till grund för kliniska patogena biofilmer, som ses i kroniska sår, sker under lång tid. Således måste varje experimentellt tillvägagångssätt som syftar till att utveckla en translationellt relevant modell för biofilmsinfektion ta hänsyn till dessa faktorer. Så vi försökte utveckla en kliniskt reproducerbar modell för kronisk biofilminfektion hos svin.
Även om studier på människor helt klart representerar det bästa sättet att studera läkningsresultat, är de ofta inte bäst lämpade för att ta itu med de underliggande mekanismerna och nya mekanistiska paradigm. Etiska problem begränsar användningen av studiedesign som kräver insamling av flera biopsier från ett kroniskt sår vid olika tidpunkter. Det är därför viktigt att ha en väletablerad och reproducerbar djurmodell för att möjliggöra invasiva studier för en grundlig undersökning av biofilmens öde 7,13. Valet av djurmodell beror på flera faktorer, inklusive vetenskaplig/translationell relevans och logistik. Svinsystemet är allmänt erkänt som den mest translationellt värdefulla experimentella modellen för att studera hudsårhos människor. Således rapporterar detta arbete en etablerad svinmodell av biofilminfekterade fullhudsbrännskador. Detta arbete är baserat på flera originalpublikationer som rapporterats i litteraturen 2,7,13,14,15,16,17. I denna studie valdes ett kliniskt isolat av multiresistent Pseudomonas aeruginosa (PA01) för att infektera såret. P. aeruginosa är en vanlig orsak till sårinfektioner 2,18,19,20. Det är en gramnegativ bakterie som kan vara svår att behandla på grund av dess resistens mot vissa antibiotika11,19,21. Ingen av de biofilmsmodeller som hittills rapporterats har involverat 8 veckors långtidsstudier 22,23,24,25,26. Kroniska sår är de som förblir öppna i 4 veckor eller mer 14,27,28. Det finns inga andra kroniska sårbiofilmmodeller rapporterade i litteraturen. Detta arbete behandlar begreppet funktionell sårförslutning 2,7,13,15,17,29.
Denna rapport ger ett detaljerat protokoll för att sätta upp en svinmodell av kronisk sårbiofilminfektion för experimentella studier. Flera svinbiofilmsmodeller har rapporterats tidigare 22,23,24,25,26, men ingen av dem är svinmodeller som involverar 8 veckors långtidsstudier. Kroniska sår är de som förblir öppna i 4 veckor eller mer 14,27,28. Det finns inga andra kroniska sårbiofilmmodeller rapporterade i litteraturen. Detta arbete behandlar begreppet funktionell sårförslutning 2,7,13,15,17,29. En studie som genomfördes 2014 var den första som rapporterade att biofilminfekterade sår kan stängas utan att barriärfunktionen7 återställs. Mätningen av hudbarriärens funktion i det läkande såret med hjälp av transepidermal vattenförlust (TEWL) rapporteras i detta arbete.
Anatomiskt och fysiologiskt är svinets hud, jämfört med huden hos andra smådjur, närmare den mänskliga huden32,33,34. Både grishud och mänsklig hud har en tjock epidermis 33, och tjockleksförhållandet mellan dermal och epidermal varierar från 10:1 till13:1 hos gris, vilket är jämförbart med 34,35 hos människor. Histologiskt och biomekaniskt visar huden hos människor och grisar likheter i rete-åsar, subdermalt fett, dermalt kollagen, hårfördelning, adnexala strukturer och blodkärlens storlek och fördelning36,37,38. Funktionellt delar både grisar och människor likheter i sammansättningen av lipid-, protein- och keratinkomponenterna i epidermisskiktet, såväl som jämförbara immunhistologiska mönster37,38. Grisars immunsystem, jämfört med andra smådjurs, har större likheter med människans immunsystem, vilket innebär att grisar är en lämplig modell för studier av värdinteraktioner som är integrerade i komplexiteten hos den patologiska biofilmen vid sårinfektioner39. Den kritiska bedömningen av för- och nackdelar med olika djurmodeller har lett till konsensus om att grisar utgör en effektiv modell för att studera sårläkning34,38. Dessutom utvecklar tamgrisar spontant kroniska bakterieinfektioner, vilket observerats hos människor10. Brännskadeanordningen som används för att skapa såren är en avancerad och automatiserad brännskadeanordning som levererar värmeenergi baserat på en temperaturavläsning från det riktade hudstället22,40. Ett sådant tillvägagångssätt förbättrar strängheten och reproducerbarheten av brännskadan. Användningen av humana kliniska isolat av bakterier för att infektera grissår ger mervärde som en preklinisk modell.
Brännskador är komplexa och orsakar flera systemiska störningar20,41. Därför är det viktigt att återuppliva grisen med tillräcklig vätska och förhindra hypotermi under anestesi och återhämtning. Flera faktorer kan störa sårläkningen, inklusive näring efter brännskada, vätska och smärta42. Det är därför viktigt att noggrant övervaka närings- och smärtbedömningarna. Smärta efter brännskador kan vara svår och påverka djurets beteende och kost. Interventioner för att ta itu med beteendeproblem måste övervägas aktivt. Regelbunden och kontinuerlig smärtbedömning och hantering är absolut nödvändigt. Ett grundligt smärtbedömningsblad med en mycket detaljerad smärthanteringsplan ingår i detta protokoll. För att undvika korskontaminering mellan såren bör särskild uppmärksamhet ägnas åt att applicera det första lagret av förbandet på varje sår separat. Kritisk försiktighet bör iakttas vid hantering av alla biologiskt farliga material och vid noggrann desinfektion av utrustning, verktyg och hela operationssalen. Appliceringen av flera lager av förbandet förhindrar att grisen exponerar såren under sina ansträngningar att gnugga eller klia tillbaka klådan.
Grisen i den aktuella modellen var inte komprometterad av underliggande metabola störningar (t.ex. diabetes), och därför var effekten som studerades enbart effekten av den bakteriella biofilminfektionen på sårläkning. Modellen lämpar sig dock för induktion av diabetes (med hjälp av streptozotocin till exempel) och skulle kunna användas för att studera biofilmsinfektion i relation till en underliggande metabol sjukdom. Den andra begränsningen i modellen är den kontrollerade infektionsinställningen med hjälp av bakterien P. aeruginosa. Det förväntas att grisens normala mikroflora i huden också kan växa i såret och påverka läkningen. Ytterligare analys med NGS eller andra avancerade tekniker för att avgränsa det mikrobiella innehållet i såret är nödvändig. Den nuvarande modellen kan också tillämpas på blandinfektioner med olika mikrobiella arter (t.ex. svamp, virus osv.). Detta är en viktig faktor, eftersom kliniskt relevanta sår sannolikt kommer att befolkas av blandade mikrober, vilket kan påverka sårläkningen på olika sätt.
Det finns många potentiella fördelar med denna modell, inklusive likheten med komplexiteten och de långsiktiga följdsjukdomarna hos mänskliga kroniska sår, den automatiserade och reproducerbara brännskadeprocessen och användningen av kliniskt isolerade bakteriearter. Användningen av flera icke-invasiva avbildningsmetoder representerar ett kraftfullt tillvägagångssätt för att samla in användbara fysiologiska data som karakteriserar såret. Slutligen är bedömningen av den funktionella sårläkningen genom återställande av hudens barriärfunktion baserat på TEWL avgörande. Sammanfattningsvis visas ett robust, enkelt, detaljerat och lättanvänt protokoll för att utveckla en biofilminfekterad allvarlig brännskada med hjälp av ett grismodellsystem i detta arbete.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University, för deras stöd och veterinärvård av djuren under studien. Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health-anslagen NR015676, NR013898 och DK125835 och försvarsdepartementets anslag W81XWH-11-2-0142. Dessutom gynnades detta arbete av följande National Institutes of Health-utmärkelser: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 och NS42617.
Sedation | |||
Ketamine | Zoetis | 10004027 | 100mg/ml |
Telazol | Zoetis | 106-111 | 100mg/ml |
Xylazine | Pivetal | 04606-6750-02 | 100mg/ml Anased |
3ml syringe w/ 20g needle | Covidien-Monoject | 8881513033 | |
Winged infusion set 21g | Jorgensen Labs | J0454B | |
Anesthetic | |||
Isoflurane | Pivetal | 21295097 | |
Surgery | |||
Hair clippers | Wahl | 8787-450A | |
Nair | Church and Dwight Co. Inc | 70506572 | |
Chlorhexidine Solution | First Priority Inc. | 179925722 | |
70% Isopropyl Alcohol | Uline | S-17474 | |
0.9% Saline Solution | ICU Medical | RL-7282 | |
Non-woven gauze | Pivetal | 21295051 | |
Paper tape | McKesson | 455531 | |
2" Elastic tape | Pivetal | 21300869 | |
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Spay hook | Jorgensen Labs | J0112A | |
Sterile lube | McKesson | 16-8942 | |
Laryngoscope | Jorgensen Labs | J0449S | |
Roll gauze | Pivetal | 21295032 | |
Endotracheal tube (7-9mm) | Covidien | 86112 | Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed |
15gtt/ml IV administration set | ICU Medical | 12672-28 | |
LRS 1000ml bag | ICU Medical | 07953-09 | |
Three Quarter Drape Sheet | McKesson | 16-i80-12110G | |
Analgesia | |||
Buprenorphine | RX Generics | 42023-0179-05 | 0.3mg/ml |
Fentanyl Transdermal | |||
Carprofen | 21294548 | Pivetal | 50mg/ml Levafen |
Bandaging | |||
Transparent film dressing 26×30 | Genadyne Biotechnologies | A4-S00F5 | |
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style | McKesson | 886408 | |
Vetrap | 3M | 1410BK BULK | |
Elastic tape 4" | Pivetal | 21300931 | |
Kerlix Roll Gauze | Cardinal Health | 3324 | |
Imaging | |||
Canon EOS 80D | Canon | 1263C004 | |
Speedlight 600EX II-RT | Canon | 1177C002 | |
EFS 17-55mm Ultrasonic | Canon | 1242B002 | |
GE Logiq E9 | GE | 5197104-2 | |
ML6-15 Probe | GE | 5199103 | |
PeriCamPSI | Perimed | 90-00070 | |
DermaLab | Cortex Technologies Inc | 4608D78 | |
Biopsy/Tissue Collection | |||
6mm punch biopsy | Integra Lifesciences | 33-36 | |
bupivicaine 0.5% | Auromedics Pharma | 55150017030 | |
Size 10 Disposable Scalpel | McKesson | 16-63810 | |
Dissection scissors | Pivetal | 21294806 | |
Rat tooth thumb tissue forceps | Aesculap | BD512R | |
Non-adherent Dressing | Covidien | 2132 | Telfa |
50ml Conical tube | Falcon | 352070 | |
Eppendorf/microcentrifuge tube | Fisherbrand | 02-681-320 | |
OCT Cassette | |||
Non Woven Gauze 4×4 | Pivetal | 21295051 | |
Inoculum | |||
Low salt LB agar | Invitrogen | 22700-025 | |
Low salt LB broth | Fisher scientific | BP1427-500 | |
Petri plate | Falcon | REF-351029 | |
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) | Falcon | REF-352059 | |
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) | Thermo Scientific | OXCM0559B | |
LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | 22700025 | |
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | |
Euthanasia | |||
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 9373 |